Summary
Variation phénotypique des traits peut résulter de mutations dans le cis-régulation élément (CRE) des séquences que les modèles de contrôle l'expression des gènes. Méthodes pour une utilisation dérivée de Drosophila melanogaster peuvent comparer quantitativement les niveaux de la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique médiée par des variantes de la CRE modifiés ou naturelle.
Abstract
Profils d'expression génique sont spécifiées par l'élément cis-régulatrices (CRE) des séquences, qui sont aussi appelés rehausseurs ou cis-régulation des modules. Un classique de la CRE possède un arrangement de sites de liaison pour plusieurs protéines facteur de transcription qui confèrent une logique réglementaire précisant quand, où et à quel niveau le gène réglementé (s) est exprimée. L'ensemble complet des CRE au sein d'un génome animal encode le programme de l'organisme pour le développement 1 et empiriques ainsi que des études théoriques indiquent que des mutations dans CRE a joué un rôle prépondérant dans l'évolution morphologique 2-4. Par ailleurs, le génome humain études d'association indiquent que la variation génétique à Cres contribuer sensiblement à la variation phénotypique 5,6. Ainsi, la compréhension logique de la réglementation et la façon dont les mutations affectent telle logique est un objectif central de la génétique.
Transgènes Reporter fournir une méthode puissante pour étudier la fonction in vivotion de Cres. Voici une séquence connue ou suspectée CRE est couplé à promoteur hétérologue et des séquences codant pour un gène rapporteur codant pour une protéine facilement observables. Quand un transgène rapporteur est inséré dans un organisme hôte, l'activité de la CRE devient visible sous la forme de la protéine rapporteur codée. Transgénèse médié par la P-élément dans l'espèce de mouche drosophile (D.) melanogaster 7 a été utilisé pendant des décennies pour introduire des transgènes rapporteur dans cet organisme modèle, bien que le placement en génomique des transgènes est aléatoire. Ainsi, l'activité du gène rapporteur est fortement influencée par la chromatine des gènes et l'environnement locaux, limitant les comparaisons qualitatives CRE pour être. Ces dernières années, le système d'intégration basé PhiC31 a été adapté pour une utilisation chez D. melanogaster pour insérer des transgènes dans spécifiques de 80 à 10 sites de débarquement du génome. Cette capacité a fait de la mesure quantitative des gènes et, pertinent ici, la CRE d'activité 11-13 Feasible. La production de mouches des fruits transgéniques peuvent être externalisées, notamment PhiC31 intégration basée, éliminant le besoin d'acheter du matériel coûteux et / ou avez une maîtrise spécialisée dans l'injection des protocoles transgène.
Ici, nous présentons un protocole général d'évaluer quantitativement une activité de la CRE, et de montrer comment cette approche peut être utilisée pour mesurer les effets d'une mutation introduite sur l'activité de la CRE une et de comparer les activités des CRE orthologues. Bien que les exemples donnés sont pour une activité de la CRE pendant la métamorphose mouche des fruits, l'approche peut être appliquée à d'autres stades de développement, les espèces de mouches des fruits, ou des organismes modèles. Finalement, une utilisation plus généralisée de cette approche de la CRE d'étude devrait faire progresser la compréhension de la logique réglementaire et comment la logique peut varier et évoluer.
Protocol
Vue d'ensemble:
Cette vidéo montre un protocole capable de mesurer quantitativement les activités de régulation génique pour le cis-régulatrices élément (CRE) des séquences de la drosophile (D.) melanogaster. Ce protocole peut être utilisé pour comparer les activités de réglementation possédé par: type sauvage et mutant formes CRE, naturelle allèles CRE trouve au sein d'une espèce ou entre espèces CRE orthologues divergé.
1. Spécifiques au site d'intégration des transgènes dans le génome de reporter de Drosophila melanogaster
Reporter A. transgène de la construction
- Dans un premier temps, tout doit être évalué CRE séparément cloné dans un vecteur rapporteur qui contient un (1) attB séquence bactérienne du site de fixation utilisé pour les sites spécifiques d'intégration transgène 8-11 (2) site de clonage multiple en amont d'un (3) promoteur hétérologue qui est suivie par la séquence (4) codant pour une lampe fluorescenteprotéines (tels que EGFP ou DsRed).
- Alors que tout vecteur peut être rendue compatible pour PhiC31 spécifiques au site d'intégration médiée par l'introduction d'une séquence attB dans le squelette vecteur, le vecteur pS3aG12-14 peut être obtenu à partir du référentiel addgene plasmidique (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG est une version personnalisée de la transformation P-base vector15 dans lequel l'un des deux isolateurs gitane a été remplacé par un isolant CTIE, il contient un site de clonage améliorée multiples, et possède une séquence 250 paires de bases contenant un site d'attachement attB. CRE d'intérêt sont insérés dans le site de clonage multiple en amont d'un promoteur hsp70 minimal et le gène EGFP qui encode une version améliorée de la protéine fluorescente verte qui se localise dans le noyau.
B. spécifiques au site d'intégration des transgènes journaliste
- Pour un ensemble de CRE, dont les activités sont à comparerD comme une partie de vecteurs transgène journaliste, les vecteurs sont créés séparément intégrées dans le site d'atterrissage génomique mêmes. Voici la protéine intégrase phagique PhiC31 catalyse la recombinaison unidirectionnelle entre le site d'attachement (attB) bactériennes dans le vecteur du transgène et un phage génomiquement situé le site d'attachement (attP) 9. Plusieurs groupes de 8 à 11 ont fait une variété de lignées transgéniques qui comprennent un site attP (sites de débarquement soi-disant) et contiennent une source génomique 8 de PhiC31 qui exprime cette protéine dans les cellules germinales. Ces stocks mouche peut être facilement obtenus à partir du centre de Bloomington drosophile stocks (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- Un protocole existe publié détaillant comment créer transgéniques drosophile site-spécifique en utilisant l'intégrase PhiC31 16. L'équipement et l'expertise technique pour faire transgéniques drosophile linda n'est plus nécessaire que plusieurs fournisseurs existent (tableau 1) à qui ce service peuvent être externalisées.
- Transgene comportements peuvent varier considérablement d'un tissu à des 11 prochaines. Ainsi, un site d'atterrissage seule attP n'est pas optimal pour l'analyse de tous les CRE, les stades de développement, et / ou des tissus d'étude. Il est conseillé d'évaluer l'activité d'un CRE d'intérêt dans plusieurs sites d'atterrissage différents afin de trouver un site où l'activité de la CRE est représentatif du gène cible endogène (s) motif d'expression.
- Pour obtenir des lignées transgéniques, il est conseillé de les faire homozygotes pour le transgène. L'activité de la CRE est généralement plus robuste chez les personnes ayant deux copies du transgène et pour des mesures quantitatives, il est impératif que les comparaisons sont faites entre les individus avec le même nombre de copies du transgène. Individus homozygotes peuvent être obtenus grâce à l'utilisation de chromosomes équilibreur. Pour les sites d'atterrissage ainsi caractérisé cependant, il est souvent simpler pour collecter les mâles et les femelles vierges, et traverser ceux qui ont le phénotype couleur des yeux plus intense conférée par le gène mini-blanc (Fig. 1), comme le sauvetage blanche mutant fournie par le vecteur du transgène intégré est plus dramatique chez les personnes avec deux vecteurs des copies.
2. Obtenir des échantillons ou des tissus de l'étape de développement approprié
Prélever des échantillons pour analyse au moment du développement où le profil d'expression génique (s) d'intérêt surviennent (s) endogène, donc le moment où l'objet d'une enquête de la CRE devrait activer l'expression du gène rapporteur. Pour la drosophile, ce qui peut être soit embryonnaire, larvaire, pupal ou adulte. Ci-dessous nous décrivons une méthode de mettre en scène les mouches adultes et métamorphiques; dont la dernière a lieu à l'intérieur du puparium, une peau dure des larves qui contient l'échantillon immobile jusqu'à ce qu'il ecloses comme un adulte.
- Développer des lignées transgéniques pour assurer Specimens de la scène appropriée sont disponibles lorsque prêt à analyser l'expression du gène rapporteur par microscopie confocale. Mettre en place des deux flacons de chaque avec plusieurs (~ 5 - 10) mouches mâles et femelles. Les jours en alternance, bump les mouches de l'un des flacons dans un flacon inutilisé. Répétez cette opération pour une semaine. À la fin de deux semaines, les mouches à fruits transgéniques seront disponibles à partir des larves qui vont à l'adulte stades de développement.
- Staging mouches adultes: La durée du temps passé dans un puparium est de 98 heures pour les femelles et 102 heures pour les hommes lorsqu'ils sont élevés à 25 ° C. Mouches adultes peuvent être facilement collectées quand ils émergent de la pupe (appelé éclosion). Cette timepoint peut être considérée comme 0 Eclosion heures après. Mouches adultes peuvent être élevés jusqu'à la date jalon nécessaire à l'analyse. Par exemple, un CRE appelé mel-OE1 qui contrôle l'expression du gène dans le desatF oenocytes adulte de D. femelles melanogaster n'est pas actif immédiatement après l'éclosion, mais l'activité de la CRE switches sur le bout d'un jour 14. Lorsque la scène correcte est obtenue, anesthésier les mouches et les situer dans une goutte d'huile sur les halocarbures sur une lame et de procéder à l'évaluation confocale.
- Staging des spécimens pendant la métamorphose: A la fin de la troisième étape-larvaire de la pupe est formée. Bien que, à ce stade de l'animal est techniquement encore un troisième stade larvaire, ce stade de développement est facilement identifiable comme le spécimen est non mobiles, la pupe est doux et blanc, et les stigmates ont éversée (Fig. 2A). Cette timepoint peut être considérée comme 0 heures après la formation puparium (hAPF). A ce stade, les mâles peuvent être distingués des femelles par la présence de gonades bilatérale située près du point médian du corps qui apparaissent comme des cercles translucides (en boîte dans la Fig. 2A et indiqué par la flèche noire en 2A »).
1. Mise en scène fondée sur la durée de la métamorphose:
À 0 hAPF, les spécimens peuvent être transférés à un flacon de fraisou une boîte de Petri en utilisant un pinceau imbibé. Pour conserver les échantillons de sécher, ajouter un morceau de Kimwipe et humidifier avec de l'eau. Flacon de transfert ou un plat d'un incubateur à 25 ° C jusqu'à ce que le hAPF désiré.
2. Mise en scène caractéristiques morphologiques visibles:
Il est souvent incommode pour analyser les échantillons pour l'activité de la CRE à un point temporel spécifique après la collecte de spécimens hAPF 0. Alternativement, on peut identifier correctement mis en scène les spécimens à un moment opportun pour une analyse basée sur la présence et la position de plusieurs marqueurs morphologiques (détaillées ci-dessous) qui sont visibles à travers le puparium ou après l'élimination puparium (Fig. 2).
2a. Critères morphologiques pour l'approximation des étapes métamorphiques:
- 0 hAPF: Blanc prénymphe stade où la larve cesse de se déplacer; spiracles antérieure éversée (flèche sur la figure 2A.); Latéraux trachée visible; blanc doux puparium (figure 2A).
- ~ 14 hAPF:Tanné et durci puparium; tête du sac éversée; trachée latérale et gonades moins distinctes; pattes et des ailes entièrement déployée le long abdomen; tubes de Malpighi n'est pas encore en vue et vert (région encadrée en pointillés dans la figure 2B.); Les yeux sont non pigmentée (figure 2B) .
- ~ 25 hAPF: Deux parallèles tubes de Malpighi éminents et de couleur verte (région encadrée en pointillés dans la figure 2C)..
- ~ 40 hAPF: Dark corps vert jaune positionné entre les extrémités antérieures des tubes de Malpighi (rouge flèche dans la figure 2D)..
- ~ 50 hAPF: corps jaune positionné au point médian de la tubules de Malpighi (. Région encadrée de la figure 2E et agrandi en''2E) et les yeux sont de couleur ambrée si le type sauvage pour gène blanc (nécessaire pour la couleur des yeux rouges) . La couleur des yeux qui manque à ce stade où le phénotype blanc mutant est sauvé par le gène mini-blanc qui fait partie de l'intégration journaliste transgène vecteur (Fig. 2E).
- ~ 80 hAPF: bouts d'aile grise; tubes de Malpighi situé entre antérieure à la médiane de l'abdomen (. Région encadrée de la figure 2G et agrandi en 2G "); plis entre les segments abdominaux et des poils sur les tergites abdominaux sont visibles (Fig. 2G et 2G "), et la couleur des yeux est rouge vif sauvé (Fig. 2G).
- ~ 90 hAPF: Wings assombri au noir; tubes de Malpighi et le corps jaune, obscurci par tannage des tergites; thoracique (flèche) et des douleurs abdominales poils sont matures et sombres (Fig. 2H); et le méconium verte apparaît à l'extrémité dorsale postérieure de l'abdomen ( Fig. 2H'').
Notes:
- À Lales étapes de la métamorphose TE, le sexe des spécimens peuvent être déterminés par la morphologie génitale (pointes de flèches dans la Fig. 2I et 2J) ou la présence du sexe assombri peignes sur le premier jeu de jambes des hommes.
- Plus de précision la mise en scène peut être réalisé en prenant en considération d'autres marqueurs morphologiques comme décrit précédemment 17.
D. Étapes pour éliminer les spécimen de puparium:
- Avec du ruban de laboratoire adhèrent un morceau de ruban d'emballage à un conseil de dissection avec la surface collante vers le haut.
- Mouillez un pinceau et appliquez l'humidité de spécimens pupariated. Utiliser un pinceau, le transfert des échantillons à un Kimwipe.
- En utilisant une pince ou d'un pinceau, des spécimens de transfert, à la bande d'emballage et d'adhérer à la surface dorsale vers le haut (côté incurvé de la pupe).
- Laisser sécher les spécimens d'environ 15 minutes. Puparium à sec sont beaucoup plus faciles à ouvrir que ceux qui sont humides. A ce stade, les spécimens peuvent être grossièrement mis en scène par morphologiquemarqueurs visibles à travers la pupe.
- En utilisant des pinces, ouvrir progressivement le début puparium à l'opercule antérieur et se diriger vers l'extrémité postérieure. Si une dissection plus fine échelle est nécessaire pour isoler un tissu spécifique cela peut être fait dans un verre de montre avec une solution PBS. Sinon, le transfert de pupes à une goutte d'huile visqueuse HC700 sur les halocarbures (Sigma-Aldrich) sur une lame de microscope.
- Situer les échantillons sur une diapositive, en utilisant un stéréomicroscope, et en utilisant les critères ci-dessus décrite (section 2a) stade un spécimen peut être déterminé ..
3. Confocale évaluation microscopique d'expression du gène rapporteur dans un échantillon de monter ensemble
- Pour les échantillons de monter ensemble, utiliser soit les objectifs 4X ou 10X. En utilisant la fluorescence stimulée par l'exposition lampe au mercure, ou bien en regardant dans le champ lumineux, d'ajuster la platine du microscope à l'échantillon de position dans le domaine optique puis porter spécimen dans le foyer.
- Utilisation de la microsco confocalepe de logiciels, d'ajuster la longueur d'onde d'excitation pour l'EGFP (ou une longueur d'onde appropriée lorsque vous utilisez une autre protéine fluorescente).
- Pour éviter photoblanchiment un spécimen, commencer avec une intensité laser de 5-10%. Si le signal est décevante, puis augmenter l'intensité nécessaire.
- Afin d'améliorer le rapport signal sur bruit pour des images confocal, activer les paramètres du logiciel que les mesures de pixel en moyenne à partir de scans de reproduire; comme l'étalement de Kalman ou de la ligne et la moyenne de la pile. Dans notre expérience moyenne de Kalman pour trois balayages améliore le rapport signal sur bruit sans avoir pris le temps pour la collecte de l'image trop longtemps.
- Pour des comparaisons quantitatives de l'activité de la CRE, il est essentiel que l'intensité de fluorescence pour un spécimen n'a pas saturés de pixels. En utilisant un z-section où apparaît la fluorescence la plus intense, ajuster les paramètres de telle sorte que quelques pixels sont saturés. Cela peut être fait en optant pour une table de consultation de saturation d'alerte et d'ajuster la tension de canal, gain et offsetaux endroits où quelques pixels sont saturés. Enfin, afin de recueillir un signal suffisamment partir d'un échantillon, il est souvent nécessaire d'ajuster l'ouverture confocale.
- Une fois les réglages optimaux sont déterminés, exécutez le z-scan.
- Lorsque l'analyse est terminée convertir la pile d'images en une projection et enregistrer cette image dans le format Tagged Image File ou «TIFF».
Note:
- Il est essentiel d'utiliser les mêmes paramètres pour tous les spécimens confocale répliquer et lignes transgène journaliste que seront inclus dans une comparaison quantitative des activités de la CRE.
4. Quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs
Alors que certains logiciels d'acquisition confocale permet pour un traitement ultérieur des images de projection, nous préférons utiliser le programme Image J librement disponible du logiciel pour évaluer les images confocale 18. Utiliser l'image J 18 a enregistré les profils d'expression de GFPpeuvent être quantifiés que les statistiques valeur de pixel dans une zone spécifiée. Bien que les images n'ont pas besoin d'être en échelle de gris, nous préférons le faire.
- Avec le programme Image J commencer, ouvrez une image TIFF doit être évalué.
- Cliquez sur le bouton de sélection à main levée et à délimiter la zone de l'échantillon où la quantification est souhaitée, par exemple la région de la figure 3 dans la bordure en pointillé jaune. (Voir note ci-dessous une concernant la sélection d'une zone à quantifier.)
- Pour obtenir une statistique de pixels, cliquez sur l'onglet Analyser puis sélectionnez mesure. Une boîte de résultats apparaîtra montrant la zone, et les scores moyens, minimum et maximum de valeur de pixel. Enregistrer le score pixel la valeur moyenne et de répéter pour générer des statistiques de valeur des pixels pour reproduire les spécimens (voir note B concernant le nombre répliquer).
- Nous recommandons la collecte d'une valeur moyenne des pixels d'une seconde zone de contrôle où la CRE n'est pas actif, par exemple la région de la figure 3 dans la bordure en pointillés rouges. Cette dernière value peut être soustraite de la valeur ancienne pour éliminer les effets de fond de la mesure pour obtenir une valeur moyenne ajustée de pixels. Dans notre expérience ce qui réduit encore la variation entre les spécimens de reproduire (voir note C concernant le choix de taille pour la région de contrôle).
- Utilisez les valeurs ajustées de pixels signifie à partir de spécimens de reproduire pour calculer la moyenne de l'activité de réglementation pour une CRE et l'erreur standard de la moyenne. Cette valeur de l'activité de régulation et de mesure de l'erreur peut être comparé à d'autres transgènes journaliste, où la séquence de la CRE se distingue (pour 3 figure par exemple).
Notes:
- Image J permet à l'utilisateur de sélectionner une forme définie et zone d'où un score de pixel la valeur moyenne sera déterminé. Cependant, comme la taille des spécimens varie souvent nous préférons utiliser l'outil de sélection à main levée pour spécifier la zone à être évalué pour chaque spécimen.
- Un plus grand nombre de répétitions (N) se traduit par une meilleure estimation de la moyenne réglementationl'activité réglementaire pour une donnée de la CRE. Nous constatons que un N entre 4 et 8 est généralement suffisante.
- Dans notre expérience, la taille de la zone de contrôle sélectionnés a peu d'effet sur la valeur de pixel moyenne mesurée pour la région de contrôle. En général, nous choisissons une zone proportionnelle de la taille de la zone d'intérêt.
5. Les résultats représentatifs:
Une version de type sauvage d'un D. melanogaster CRE, appelé l'élément dimorphe 13, entraîne un haut niveau d'expression rapporteur EGFP dans le segment de l'abdomen des femmes A6 nymphes (figure 3A). Une séquence 13 paires de bases au sein de cet élément a été trouvé pour être un site de liaison pour le facteur de transcription DSX, et l'importance in vivo de cette séquence peut être démontré par la quantification de l'activité réglementaire de ce CRE lorsque ce site de liaison est muté. Considérant l'activité réglementaire de l'élément dimorphe de type sauvage à 100 ± 5%, la mutation de ce site DSX réduit le regmentation d'activité à 28 ± 3%. Des comparaisons semblables peuvent être faites des activités de réglementation pour les allèles CRE intraspécifique ou entre CRE orthologues d'espèces distinctes. Par exemple, en considérant les niveaux de l'EGFP dans A6 segment féminin entraîné par le D. melanogaster Canton S souche comme une activité réglementaire de 100 ± 4%, CRES orthologues pour les espèces D. simulans et D. willistoni ont été trouvés respectivement possèdent des activités de réglementation égale à 75 ± 4% et 0 ± 0% (figure 3B).
Figure 1. Utilisation de l'intensité du phénotype œil blanc de sauvetage pour faire des lignées transgéniques homozygotes. Afin d'évaluer quantitativement les transgènes journaliste, il est important que chaque spécimen ont le génotype même journaliste transgène. (A) un gène mutant blanc fond génétique avec une séquence attP site d'atterrissage est utilisée pour le site-s pécifique transgène intégration. Les individus transgéniques (B) hémizygotes et (C) homozygotes pour la lutte antivectorielle intégrée peut généralement être distingués par l'intensité de la couleur des yeux phénotype sauvé par le nombre de copies du gène mini intégrés blancs. Lignées homozygotes peut être établie par croisement (C) mouches mâles et femelles avec le phénotype de couleur plus sombre des yeux.
Figure 2. Utilisant des marqueurs morphologiques pour déterminer le stade métamorphique de la drosophile. Pendant la métamorphose d'une larve d'une mouche à fruits adultes, les transitions spécimens à travers une série de morphologies stéréotypés qui peuvent être utilisés pour déterminer le sexe et approximative de la phase de développement. Les spécimens en Bosnie-Herzégovine ont été retirés de leur puparium. Boîtes de panneaux A, E, F, G et H indiquent le zoom dans les régions respectivement pour les panneaux A ", E", F ", G" et H ".
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Figure 3. Comparaison quantitative des activités élément cis-régulatrices. Pour tous les échantillons d'expression génique EGFP-reporter médiée par un élément particulier dimorphe a été évaluée chez les femelles à 80 heures après la formation puparium. Le nombre en haut de chaque image est le niveau d'expression EGFP-pour le spécimen qui est calculée comme la valeur de pixel moyenne pour le segment A6 abdominale (indiqué pour l'image la plus en haut à gauche de la région au sein de la frontière en pointillé jaune) moins la moyenne valeur d'un pixel pour le segment A4 (correction de fond; indiqué pour l'image la plus en haut à gauche de la région au sein de la frontière en pointillés rouges). Pour chaque journaliste de transgène quatre répétitions ont été évalués pour calculer une valeur segment de dire A6 pixel. Activité réglementaire est rapporté que le% de type (A) sauvages ou (B) souche Canton S féminine valeur moyenne des pixels ± SEM. (A) L'expression de GFP pour les femmes possédant un allèle de type sauvage de laElément dimorphe et une version mutante où un seul site de liaison pour le facteur de transcription a été DSX ablation. Ce site mutant contraignante activité réduite élément dimorphe à 28 ± 3% de la séquence de type sauvage. (B) Comparaison des activités de réglementation pour les séquences orthologues à l'D. Elément melanogaster dimorphe (souche Canton S). Compte tenu de la médiation par une expression de la GFP D. allèle melanogaster élément dimorphe comme 100%, les séquences orthologues de l'espèce apparentée D. simulans et D. willistoni respectivement possèdent des activités de 75 ± 4% et 0 ± 0%.
6. Matériaux
| Nom du produit | Tapez | Société | Numéro de catalogue | Commentaire |
| Spécifiques au site d'intégration du transgène | Service | Meilleur Gene | Plan H | Choisissez un site d'atterrissage, de recevoir des lignes transformant |
| Huile sur les halocarbures | Réactif | Sigma-Aldrich | H8898 | Permet de monter des spécimens pour l'imagerie confocale |
| Dumont # 5 forceps | Outil | Outils Fine Science | 11252-40 | Beaux-pointues et durables pour la dissection |
| SZ61 microscope à zoom stéréo | Outil | Olympus | Personnalisable | Optique excellente pour travailler avec des mouches des fruits |
| FluoView microscope confocal | Outil | Olympus | Personnalisable | Fournit des images haute résolution confocale |
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Discussion
éléments cis-régulateurs coder le programme génomique qui spécifie l'expression des gènes et donc le processus de développement 1, et sont des endroits bien visibles pour les deux mutations sous-jacentes évolution morphologique 2-4 et variation phénotypique des traits humains 5,6,19. En dépit de cette importance, la logique réglementaire pour CRE restent mal compris. Une raison importante de ce déficit a été la compréhension de l'absence de méthodes appropriées pour comparer quantitativement les séquences fonctionnelles de Cres. Nous présentons ici un protocole qui capitalise sur les méthodes de transgénèse améliorée pour D. melanogaster d'ajouter un aspect quantitatif de l'étude de Cres.
Dans notre expérience lors de la quantification une activité réglementaire de la CRE, la variation entre les échantillons répétition est de 10% ou moins de la valeur de pixel moyenne ajustée lors répétitions sont (1) de la même étape de développement et (2) le transgène journaliste estdans le site d'atterrissage génomique mêmes. Cette quantité de variation est conforme à celle déterminée pour la CRE a présenté dans la Figure 3, et impose une limitation sur l'utilisation de cette méthode quantitative à des situations où les versions génétiquement distincte d'une CRE diffèrent dans les activités de réglementation par une valeur supérieure à 10%. Surtout si, cette limitation est une amélioration significative par rapport aux descriptions qualitatives de la «réduction» ou «augmenté» que ceux qui étudient CRE avait auparavant à utiliser pour décrire l'activité variés.
Lorsque des versions d'un CRE sont connus ou constaté quantitativement diffèrent dans leurs activités de réglementation, ce protocole permet réalisables déterminer lequel des différences de mutations sont responsables ou contribuer à la différence 12,13 activité. La capacité à identifier ces mutations fonctionnellement pertinents est une première étape nécessaire pour déterminer les mécanismes moléculaires, telles que le gain ou la perte de transcriles sites des facteurs ption contraignante, causant des activités de la CRE diffèrent. Pour l'avenir, l'utilisation de ce protocole pour les autres CRE drosophile et l'application des méthodes similaires dans les protocoles pour les organismes autres modèles devraient permettre une meilleure compréhension de la logique de la CRE à émerger. Ceci inclut la capacité à discriminer fonctionnellement pertinents mutations CRE du bourbier de la fonctionnellement neutre mutations.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions: Nicolas Gompel et Benjamin Prud'homme pour leurs contributions à l'élaboration de ce protocole; Melissa Williams et quatre examinateurs anonymes pour leurs commentaires sur le manuscrit; l'Université de Dayton Graduate School de bourses de recherche pour la guerre, et l'Université de Dayton Biologie Ministère et l'Institut de recherche (UDRI) pour soutenir la recherche pour TMW. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association 11BGIA7280000 Subvention à TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
