Summary
특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.
Abstract
유전자 발현 패턴도 강화 또는 CIS - 규제 모듈이라고 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스에 의해 지정됩니다. 전형적인 CRE 어디에, 어떤 수준에서 규제 유전자 (S)가 표시됩니다 때, 지정 규제 논리를 부여하는 몇 가지 전사 인자 단백질에 대한 구속력이 사이트의 배열을 가지고 있습니다. 동물의 게놈 내에서 CREs의 전체 집합은 유기체의 발전 1, 경험적위한 프로그램뿐만 아니라 이론 연구 CREs에 변이가 형태학의 진화 2-4 두드러진 역할을 나타냅니다를 인코딩합니다. 또한, 인간 게놈 넓은 협회 연구 CREs에 유전자 변이가 phenotypic 변화에 크게 기여 5,6 나타냅니다. 따라서, 규제 논리를 이해하고 방법을 돌연변이 같은 논리에 영향을 미칠 것은 유전학의 중심 목표이다.
기자 transgenes은 생체내 FUNC에서 공부하는 강력한 방법을 제공CREs의 기. 여기 알려진 또는 의심되는 CRE 시퀀스는 heterologous 발기인하고 쉽게 관찰할 단백질 제품을 인코딩 리포터 유전자에 대한 코딩 시퀀스로 결합합니다. 기자의 transgene이 숙주에 삽입되면, CRE의 활동은 인코딩된 기자 단백질의 형태로 표시됩니다. transgenes의 게놈 배치가 랜덤입니다하지만 과일 파리 종의 Drosophila (D.) melanogaster 7 P - 요소 중재의 transgenesis,이 모델 생물로 기자 transgenes을 소개하는 수십 년 동안 사용되었습니다. 따라서 리포터 유전자 활동은 강력하고 질적으로 CRE 비교 제한, 지역 염색질 및 유전자 환경에 의해 영향을받습니다. 최근에는 phiC31 기반의 통합 시스템은 특정 게놈의 방문 사이트 8-10에 transgenes를 삽입 D. melanogaster에서 사용하기 위해 적응되었다. 이 기능은 CRE 활동 11-13 FE에게 유전자의 양적 측정을 시도했고, 관련 여기에있다asible. 유전자 변형 과일 파리의 생산이 고가의 장비와 /를 구입하거나 전문 transgene 분사 프로토콜에서 실력을하지 않아도 phiC31 기반의 통합을 포함하여 외주 수 있습니다.
여기서는 일반적인 프로토콜 양적 CRE의 활동을 평가하고,이 접근법은 CRE의 활동에 도입 돌연변이의 효과를 측정하고 orthologous CREs의 활동을 비교하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주기를 제시한다. 주어진 예제는 과일 파리 변태 동안 CRE 활성화를위한 있지만, 그 접근 방식은 다른 발달 단계, 과일 파리 종, 또는 모델 생물에 적용할 수 있습니다. 결국, 학습 CREs이 접근 방식보다 널리 사용 규제 논리의 이해를 사전에해야하고 어떻게 논리는 다양하고 진화하실 수 있습니다.
Protocol
개요 :
이 비디오는 양적 Drosophila (D.) melanogaster에서 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스에 대한 유전자 규제 활동을 측정할 수있는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은에 의해 소유 규제 활동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다 : 야생 유형과 돌연변이 CRE 양식이 갈라 종 사이 종, 또는 orthologous CREs 내에서 발견 CRE의 대립 유전자를 자연스럽게 - 발생.
1. Drosophila melanogaster 게놈에 기자 transgenes의 특정 사이트 통합
A. 리포터 transgene 건설
- 첫 번째 단계로, 어떤 CRE 별도로 특정 사이트 transgene 통합 8-11에 사용 (1) attB 세균 첨부 파일 사이트 시퀀스, 업스트림 (3) (2) 여러 복제 사이트를 포함하는 기자 벡터에 복제해야합니다 평가 형광에 대한 (4) 코딩 순서옵니다 heterologous 발기인단백질 (예 : EGFP 또는 DsRed 등).
- 모든 벡터는 벡터 pS3aG12 - 14은 addgene 플라스미드 저장소에서 얻을 수있다, 벡터 백본에 attB 시퀀스를 도입하여 phiC31 중재 특정 사이트 통합을위한 호환 만들 수 있지만 (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG이 두 집시 절연체 중 하나가 SfIb 절연체로 교체하는 P - 기반 변환 vector15의 사용자 지정 버전입니다, 그것은 향상된 여러 복제 사이트를 포함하고 attB 첨부 파일 사이트를 포함한 250 기본 쌍 시퀀스를 가지고 있습니다. 관심 CREs은 hsp70 최소한의 발기인과 핵에 localizes 그린 형광 단백질의 향상된 버전을 인코딩 EGFP 유전자의 상류 여러 복제 사이트에 삽입됩니다.
기자 transgenes의 B. 특정 사이트 통합
- 활동 비교 예정이다 CREs의 집합에 대한D는 기자 transgene 벡터의 일환으로, 생성된 벡터는 별도로 같은 게놈의 방문 사이트에 통합되어 있습니다. 여기 phiC31 파지의 integrase 단백질은 transgene 벡터의 세균성 (attB) 첨부 파일 사이트 및 genomically있는 파지 (attP) 첨부 파일 사이트 9 사이의 단방향 재조합을 catalyzes. 8-11 몇몇 그룹은 attP 사이트 (소위 착륙)을 포함하고 세균 세포에이 단백질을 표현 phiC31 8 게놈 소스를 포함하는 유전자 변형 라인의 다양한 만들었습니다. 이러한 플라이 주식 블루밍턴 Drosophila 주식 중심가에서 쉽게 구할 수 있습니다 (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- 게시 프로토콜 유전자 변형 Drosophila이 사이트 특별히 phiC31 integrase 16을 사용하여 만드는 방법에 대해 자세히 존재합니다. 유전자 변형 Drosophila 리를 만들기 위해 장비 및 기술 전문여러 업체 (표 1) 누구에게이 서비스를 아웃소싱 할 수있는 존재로 선은 더 이상 필요하지 않습니다.
- Transgene 동작 한 조직에서 다음 11 크게 달라질 수 있습니다. 따라서 단일 attP 착륙 사이트는 모든 CREs, 발달 단계, 및 / 또는 학습 조직의 분석을 위해 최적되지 않습니다. 그것은 CRE의 활동이 내생 대상 유전자 (들) 표현 패턴을 대표하는 사이트를 찾기 위해 여러 다른 방문 사이트에 관심 CRE의 활동을 평가하는 것이 좋습니다.
- 획득 형질 라인을 위해 이것은 transgene을 위해 그들 homozygous 만드는 것이 좋습니다. CRE 활동은 일반적으로 이틀 transgene 사본 및 양적 측정이 비교가 transgene 사본 같은 번호와 개인 사이에 만들어진 게 급선무다과 개인에 더 강력합니다. Homozygous 개인은 균형 염색체의 사용을 통해 얻을 수있다. 하지만 잘 특징 방문 사이트 들어, 자주의입니다impler는 처녀 남성과 여성을 수집, 두 벡터와 통합 transgene 벡터에서 제공하는 흰색 돌연변이 구조는 개인에 더 극적인와 같이 미니 흰색 유전자 (그림 1)에 의해 수여 더 강렬한 눈 색깔의 표현형있는 사람을 건너 복사합니다.
2. 적절한 발달 단계의 취득 표본 또는 조직
관심의 유전자 발현 패턴 (S)이 조사에서 CRE이 기자의 유전자 발현을 활성화해야합니다 (들) endogenously, 따라서 시간이 발생할 때 개발 시간에 분석을 위해 표본을 얻습니다. Drosophila 들어,이 중 배아, 애벌레, pupal 또는 성인 단계 수 있습니다. 아래 우리는 성인과 metamorphic 파리 단계 방법을 설명하고, 번데기, 그건 어른 ecloses 때까지 고정되어 표본을 포함하는 하드 애벌레 피부 안에서 이루어지는 후자 중.
- specim을 보장하기 위해 유전자 변형 라인을 확장언제 공촛점 현미경에 의한 리포터 유전자 발현을 분석할 준비가 적절한 단계의 엔터 프라이즈 네트워크를 사용할 수 있습니다. 남성과 여성 파리 - 두 병 몇 가지 (10 ~ 5)로 각각 설정합니다. 교체 일, 유리병 중 하나에서 사용하지 않는 유리병에 파리 범프. 일주일 동안이 단계를 반복합니다. 2 주간 말까지, 유전자 변형 과일 파리를 사용할 것이라고 애벌레에서 성인 발달 단계에 이르기까지 다양합니다.
- 성인 파리 준비 : 25 reared 때 번데기 안에서 보낸 시간의 기간은 여성에 대한 98시간과 남성에 대한 1백2시간있다 ° C. 그들은 번데기 (eclosion라고도 함)에서 나타날 때 어른 벌레가 쉽게 수집하실 수 있습니다. 이 timepoint 0 시간 게시 eclosion 간주될 수 있습니다. 성인 파리는 분석을 위해 필요한 timepoint까지 reared 수 있습니다. 예를 들어, CRE는 D.의 성인 oenocytes에 desatF 유전자의 표현을 제어 것을 멜 - oe1라고 melanogaster 암컷은 즉시 eclosion하지만 CRE 활동 swi 이후 활성화되지 않은일일 14 시간 이후에 tches. 정확한 단계를 얻을 때, 파리를 마취하고 ...을 놓다 슬라이드에 할로 카본 기름 한 방울과 공촛점 평가로 진행합니다.
- 변형하는 동안 표본을 준비 : 번데기가 형성 공급 instar 애벌레 단계의 끝에. 이 단계에서 동물이 기술적으로 여전히 삼분의 일 instar의 유충입니다 비록 표본이 아닌 모바일이므로,이 발달 단계를 쉽게 식별이며, 번데기는 부드럽고 흰색이며, spiracles은 (그림 2A) everted있다. 이 timepoint는 0시간 번데기 형성 (hAPF) 이후 고려하실 수 있습니다. 이 단계에서, 남성은 (2A가. 그림 박스와 "2A에서 검은색 화살표로 표시) 반투명 서클로 나타납니다 신체의 midpoint 근처에 위치한 양자 생식선의 존재에 의해 암컷에서 구분할 수 있습니다.
1. 변태의 길이에 따라 준비 :
0 hAPF에서 표본은 신선한 유리병에 전송할 수 있습니다또는 페트리가를 사용하는 요리가 페인트 브러시를 moistened. 밖으로 건조에서 표본을 유지하려면, Kimwipe의 조각을 추가하고 물로 축축하게하다. 원하는 hAPF 때까지 25 ° C 배양기로 전송 유리병이나 요리.
2. 보이는 형태학의 기능에 의해 준비 :
그것은 0 hAPF의 표본의 수집 다음과 같은 특정 timepoint에서 CRE 활동에 대한 표본을 분석하는 것이 불편합니다. 또한, 하나는 제대로 번데기이나 번데기 제거 (그림 2) 이후에 볼 수있는 여러 가지 형태학의 마커 (아래 내용)의 존재와 위치를 기반으로 분석을위한 편리한 시간에 표본을 무대 확인할 수 있습니다.
2A. metamorphic 단계 approximating에 대한 형태학의 기준 :
- 0 hAPF : 유충은 이동 중지 화이트 prepupa 무대, 앞쪽에 spiracles는 (. 그림 2A에서 화살표) everted, 측면 기관 보이는, 부드러운 하얀 번데기 (그림 2A).
- ~ 14 hAPF :빠져있었단 및 강화된 번데기, 머리 SAC everted, 수평기도와 생식선이 덜 뚜렷한; 완벽한 복부를 따라 확장 다리와 날개, (. 그림 점선 박스 영역 2B) 아직 눈에 띄는 녹색되지 Malpighian의 tubules, 눈은 unpigmented 아르 (그림 2B ') .
- ~ 25 hAPF : 색상에 눈에 잘 띄는과 녹색 두 가지 병렬 Malpighian tubules (그림 2C에서 박스 영역을 그랬어요.).
- ~ 40 hAPF : Malpighian tubules (. 그림 2D에 빨간색 화살촉)의 앞쪽에 끝이 사이에 진한 녹색 노란색 몸.
- ~ 50 hAPF : Malpighian tubules (. 그림 박스 지역 2E와 2E '의 확대)과 눈의 중간 지점에 위치 황색 몸은 색이 호박 경우에는 흰색 유전자 (빨간색 눈 색깔에 필요한)에 대한 야생 입력 . 눈 색깔은 흰색 돌연변이 표현형가 통합 기자 transgene 벡터 (그림의 2E ')의 일부 미니 흰색 유전자에 의해 구출 때이 단계에서 부족합니다.
흰색 유전자 (그림 2 층 ')에 의해 구출 때. - ~ 80 hAPF : 그레이 윙 팁, 복부의 midpoint (. 2G에서 그림 2G와 확대에 박스 영역 ")에 앞쪽에 사이에 위치 Malpighian tubules, 복부 세그먼트와 복부 tergites에 bristles 사이에 주름이 표시 (그림 2G 있으며, 2G "); 및 구출 눈 색깔은 밝은 적색 (그림 2G ')입니다.
- ~ 90 hAPF : 날개는 검은색을 어두운, tergites의 선탠로 덮여 Malpighian tubules과 노란색 바디, 흉부 (화살표)와 복부는 (그림 2 시간) 성숙하고 어두운 아르 bristles 및 녹색 meconium은 복부의 지느러미 뒷부분 끝 (에 나타납니다 그림. 2 시간 ').
참고 사항 :
- 라시변태 테 단계는 표본의 성별은 성기 형태 (그림. 2I와 2J의 화살촉) 또는 남성 다리의 첫번째 세트에 어두운 성별 빗의 존재에 의해 결정하실 수 있습니다.
- 준비에 더 정밀도는 이전에 다음 ID로 17 설명된대로 추가 형태학의 마커의 고려에 의해 얻을 수 있습니다.
D.는 번데기에서 표본을 제거하는 단계 :
- 실험실 테이프를 사용하면 위쪽으로 직면하고있는 끈적끈적한 표면 해부 보드에 테이프를 포장 한 조각을 준수합니다.
- 페인트 브러쉬를 습식 및 pupariated 표본에 수분을 적용합니다. 페인트 브러쉬를 사용하여 Kimwipe로 표본을 전송할 수 있습니다.
- 포장 테이프에 포셉 또는 화필, 전송 표본을 사용하고 (번데기의 곡선 쪽)까지 직면하고있는 지느러미 표면 준수합니다.
- 표본은 ~ 15 분 동안 건조 수 있습니다. 드라이 번데기는 촉촉한하는 것보다 열어 훨씬 쉽게됩니다. 이 시점에서 표본은 coarsely 형태학의에 의해 공연 수 있습니다번데기를 통해 볼 마커.
- 집게를 사용하면, 점진적으로 앞쪽에 operculum에서 번데기의 시작을 열고 뒷부분 끝쪽으로 진행합니다. 더 좋은 규모의 해부가 특정 조직을 분리하는 데 필요한 경우 이것은 PBS 솔루션으로 시계 유리로 이루어 질 수 있습니다. 그렇지 않으면, 현미경 슬라이드에 점성 HC700 할로 카본 오일 (시그마 - 올드 리치)의 방울로 pupae를 전송할 수 있습니다.
- stereomicroscope를 사용하고, 표본의 단계가 결정 위에서 설명한 기준 (섹션 2A)를 사용하여 슬라이드에 표본 ...을 놓다 ...
3. 전체 마운트 예제에서 리포터 유전자 표현의 공촛점 현미경 평가
- 전체 마운트 표본은 4X 또는 10X 목표 중 하나를 사용합니다. 수은 램프 노출에 의해 자극을 형광을 사용하거나, 또는 밝은 분야에서 보면, 다음 포커스로 표본을 가지고 광학 분야에서 위치 검체로 현미경 단계를 조정합니다.
- 공촛점 microsco를 사용하여PE 소프트웨어는 EGFP 위해 여기 파장 (또는 다른 형광 단백질을 사용하여 적합한 파장) 조정할 수 있습니다.
- 표본을 photobleaching 방지하기 위해 50~10%의 레이저 강도로 시작합니다. 신호 underwhelming 경우 필요에 따라 다음 강도를 높일 수 있습니다.
- 공촛점 이미지에 대한 잡음 비율로 신호를 개선하기 위해, 소프트웨어 설정을 사용하는 것이 복제 검사에서 평균 픽셀 측정, 같은 칼만의 평균 또는 라인과 스택 평균으로. 우리의 경험에 세 스캔에 대한 칼만의 평균이 너무 깁니다 이미지 수집을위한 시간을 만드는 않고 잡음 비율로 신호를 향상시킵니다.
- CRE 활동의 양적 비교를 위해 그것은 표본에 대한 형광 강도가 많은 픽셀 포화되지 않았음을 중요합니다. 몇 픽셀이 포화되도록 형광 가장 강렬 나타나는 Z - 섹션을 사용하여 설정을 조정합니다. 이것은 채도 - 경고 조회 테이블로 스위칭 및 채널 전압 이득을 조정하여 수행하고, 오프셋 수 있습니다몇 픽셀이 포화 아르 설정합니다. 마지막으로, 표본에서 충분한 신호를 수집하기 위해서는 자주 공촛점 조리개를 조절하는 것이 필요합니다.
- 최적의 설정이 결정되면, Z - 스캔을 실행합니다.
- 검사가 완료되면 프로젝션에 이미지 스택을 변환하여 태그가 지정된 이미지 파일 형식 또는 "TIFF"에서 이미지를 저장합니다.
참고 :
- 그것은 CRE 활동의 양적 비교에 포함 될 모든 복제 표본 및 기자 transgene 라인에 동일한 공촛점 설정을 사용하는 것이 필수적입니다.
4. CIS - 규제 요소의 활동을 Quantifying
일부 공촛점 수집 소프트웨어는 프로젝션 이미지의 추가 처리를 위해 수 있지만, 우리는 공촛점 이미지 18를 평가하기 위해 자유롭게 사용할 이미지 J 소프트웨어 프로그램을 사용하는 것을 선호합니다. 이미지를 사용하면 J 18 기록 GFP 발현 패턴지정된 지역 내에서 픽셀 값이 통계로 계량하실 수 있습니다. 이미지가 그레이 스케일에있을 필요가 없습니다 비록 우리가 그렇게하는 것을 선호합니다.
- 이미지 J 프로그램 시작하기, 평가하기 위해 TIFF 이미지를 엽니다.
- 프리핸드 선택 버튼을 클릭하고 quantitation가 원하는되는 시편의 영역을 설명하고, 점선 노란색 테두리 안에 그림 3에서 예를 들어 지역을 위해. (quantitate하는 영역의 선택에 관한 아래의 참고를 참조하십시오.)
- 픽셀 값 통계를 얻으려면, 분석 탭을 누른 다음 측정을 선택합니다. 결과 상자 영역을 보여주는 표시하고, 말은, 최소 및 최대 픽셀 값 점수 것입니다. 평균 픽셀 값을 점수를 기록하고 (복제 번호에 관한 참고 B를 참조) 복제 표본에 대한 픽셀 값을 통계를 생성하는 반복합니다.
- 예를 들어 지역을 그림 3에서 점선 빨간 테두리 내에서, 우리는 CRE이 활성화되지 않은 컨트롤 영역에서 두 번째 의미의 픽셀 값을 수집하는 것이 좋습니다. 이 후자의 발UE는 조정 평균 픽셀 값을 얻기 위해 측정에서 배경 효과를 제거하기 이전 값에서 빼서 수 있습니다. 우리의 경험이 더 복제 표본 (제어 영역 크기 선택에 관한 참고 C 참조) 사이의 변화를 줄여줍니다.
- CRE와 의미의 표준 오류의 평균 규제 활동을 계산하기 위해 복제 표본에서 조정 의미 픽셀 값을 사용합니다. 이 규제 활동의 가치와 오류의 측정은 CRE의 순서가 차이가 다른 기자 transgenes (예를 들어 그림 3)으로 비교할 수 있습니다.
참고 사항 :
- 이미지 J는 의미 픽셀 값 점수가 결정되는에서 정의된 형태와 영역을 선택하는 사용자가 있습니다. 표본의 크기가 종종 다릅니다 그러나, 우리는 각각의 표본에 대해 평가할 수있는 영역을 지정하려면 자유형 선택 도구를 사용하는 것을 선호합니다.
- 평균 regu의 더 나은 추정에 복제의 큰 숫자 (N)는 검색 결과주어진 CRE에 대한 latory 활동. 우리는 4와 8시 사이에 n은 일반적으로 충분 것을 발견했습니다.
- 우리의 경험에서 선택한 컨트롤 영역의 크기가 조금 제어 지역의 측정된 평균 픽셀 값을 영향을했다. 일반적으로, 우리는 관심 영역의 크기에 비례 영역을 선택합니다.
5. 대표 결과 :
D.의 야생 타입 버전 melanogaster CRE는 동종 이형의 요소 13이라는 여성 pupae (그림 3A)의 A6 복부 세그먼트에서 EGFP 기자의 표현의 높은 수준의 드라이브. 이 요소 내에 13 기본 쌍 순서는 DSX의 전사 인자에 대한 구속력있는 사이트로 발견,이 순서의 생체내 중요성이 바인딩 사이트가 변이되면이 CRE에 대한 규제 활동을 quantifying 입증하실 수 있습니다. 100 살까지 야생 유형 동종 이형의 요소의 규제 활동 ± 5 %를 고려이 DSX 사이트의 돌연변이 등록을 감소28 ulatory 활동 ± 3 %. 비슷한 비교는 intraspecific CRE의 대립 유전자 또는 별도의 종 orthologous CREs 사이에 규제 활동을 할 수 있습니다. 예를 들어, D.에 의한 여성의 세그먼트 A6에서 EGFP의 수준을 고려 100 규제 활동으로 melanogaster 광동 S 응력 ± 4 %, 종족에 대한 orthologous CREs D. simulans와 D. willistoni는 각각 75 동등한 규제 활동을 ± 4 % 0 ± 0 % (그림 3B) 소유로 발견되었습니다.
그림 1. 유전자 변형 라인이 homozygous 수 있도록 흰색 구조 안구 표현형의 강도를 사용합니다. 양적 기자 transgenes을 평가하기 위해서는 각 표본이 같은 기자 transgene의 유전자형을 가지고하는 것이 중요합니다. (A) attP 방문 사이트 순서로 흰색 유전자 돌연변이 유전 배경이 사이트의 활용입니다 pecific transgene 통합. 유전자 변형 개인은 (B) hemizygous 및 통합 벡터에 대한 (C) homozygous는 일반적으로 통합 미니 흰색 유전자의 매수에 의해 구출 눈 색깔의 표현형의 강도로 구분할 수 있습니다. Homozygous 라인은 어두운 눈 색깔의 표현형과 교차 (C) 남성과 여성의 파리로 설정할 수 있습니다.
그림 2. Drosophila에 대한 metamorphic 단계를 결정하기 위해 형태학의 마커를 사용합니다. 유충에서 성인 과일 비행을 변형하는 동안, 성별, 대략적인 개발 단계를 결정하는 데 사용할 수 stereotypic morphologies 일련의를 통해 표본 전환. BH의 표본들은 번데기에서 삭제되었습니다. 패널 A, E, F, G와 H의 상자 "는 패널에 각각 지역의 확대", E ', F', G ', 그리고 H를 나타냅니다.
"그림 3"SRC = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg"/>
그림 3. CIS - 규제 요소 활동의 양적 비교. 모든 샘플에 대한 특정 동종 이형의 요소로 인한 EGFP - 리포터 유전자 표현은 번데기 형성 후 80시간에서 여성에서 평가되었다. 각 이미지의 상단에있는 숫자는 A6 복부 세그먼트에 대한 의미 픽셀 값 (점선 노란색 테두리 내에있는 지역으로 왼쪽 상단 가장 이미지의 표시) 마이너스 의미로 계산되는 표본에 대한 EGFP 표현 수준입니다 A4 세그먼트에 대한 픽셀 값 (배경 보정, 점선 빨간 테두리 내에있는 지역으로 왼쪽 상단 가장 이미지의 표시). 각 기자에 대한 transgene 넷은 복제는 의미 세그먼트 A6 픽셀 값을 계산하는 평가했다. 규제 활동은 (A) 야생 유형의 % 또는 (B) 광동 S 변형 여자가 픽셀 평균값 ± SEM으로보고됩니다. 의 야생 유형 allele을 가진 여성을위한 (A) GFP 발현동종 이형의 요소와 DSX의 전사 인자에 대해 하나의 구속력있는 사이트가 ablated되었습니다 돌연변 버전입니다. 이 돌연변이 바인딩 사이트는 28 동종 이형의 요소의 활동을 감소 ± 야생 입력 시퀀스의 3 %. D.에 orthologous 시퀀스에 대한 규제 활동 (B) 비교 melanogaster (광동 S 변형) 동종 이형의 요소입니다. D.하여 GFP 발현의 중재를 고려 백퍼센트로 melanogaster 동종 이형의 요소 allele, 관련 종 orthologous 시퀀스 D. simulans와 D. willistoni은 각각 75 활동을 가진 ± 4 % 0 ± 0 %.
6. 자료
| 재료 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 논평 |
| 특정 사이트 transgene 통합 | 서비스 | 최고의 진 | 계획 H | 착륙 지점을 선택 transformant 라인을 받게 |
| 할로 카본 오일 | 시약 | 시그마 - 올드 리치 | H8898 | 공촛점 이미징에 대한 표본을 마운트하는 데 사용 |
| 뒤몽 # 5 집게 | 도구 | 파인 과학 도구 | 11252-40 | 지적 파인과 절개에 대한 내구성 |
| SZ61 줌 스테레오 현미경 | 도구 | 올림포스 산 | 사용자 정의 | 과일과 협력을위한 뛰어난 광학 난다 |
| FluoView 공촛점 현미경 | 도구 | 올림포스 산 | 사용자 정의 | 고해상도 공촛점 이미지를 제공합니다 |
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Discussion
CIS - 규제 요소는 유전자 발현 패턴 및함으로써 개발 1의 프로세스를 지정 게놈 프로그램을 인코딩하고, 인간의 특징 5,6,19에 대한 형태학의 진화 2-4과 phenotypic 변화를 기본 두 변이에 대한 눈에 띄는 위치하고 있습니다. 이 중요성에도 불구하고, CREs에 대한 규제 논리가 제대로 이해 남아있다. 이 이해 적자에 대한 유명한 이유는 양적 CREs의 기능 시퀀스를 비교하는 적절한 방법의 부족했습니다. 여기 D. melanogaster이 CREs의 연구에 양적 측면을 추가할 수 있도록 개선 transgenesis 방법에 capitalizes 프로토콜을 제시한다.
복제가 (1) 동일한 발달 단계 및 (2) 기자의 transgene이 때 우리의 경험에서 CRE의 규제 활동을 quantifying 때, 복제 표본 사이의 편차는 조정 의미 픽셀 값의 10 % 이하입니다동일한 게놈 방문 사이트 인치 변화의이 금액은 그림 3에 표시되는 CREs에 대한 판단과 일치하고, CRE의 유전자 독특한 버전의 10 %보다 큰 값으로 규제 활동에 차이가 상황이 정량 방법의 사용에 제한을두고 있습니다. 중요한하지만,이 제한은 그 공부 CREs 이전에 다양한 활동을 설명하는 때 사용할 것을 "감소"또는 "증가"의 질적 설명을 통해 상당한 개선이다.
CRE의 버전이 알려지거나 그들의 양적 규제 활동에 차이가 발견되는 경우,이 프로토콜에 대한 책임이나 활동 차이 12,13에 기여 mutational 차이점 중 어떤 결정 가능합니다. 이러한 기능 - 관련 변이를 식별하는 능력은 그러한 transcri의 이득 또는 손실로 분자 메커니즘을 결정하기 위해 필요한 첫 번째 단계입니다CRE 활동이 차이가 발생 ption 인자 바인딩 사이트. 기대, 다른 Drosophila의 CREs 및 기타 모델 생물에 대한 프로토콜에서 유사한 방법의 응용 프로그램에 대해이 프로토콜의 사용이 등장하는 CRE 논리의 더 나은 이해를 허용해야합니다. 이 기능 중립적인 돌연변이의 소택지에서 기능 - 관련 CRE의 변이를 차별하는 능력을 포함하고 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 감사 : 니콜라 Gompel이 프로토콜의 발전에 그들의 공헌에 대해 벤자민 Prud'homme, 멜리사 윌리엄스와 원고에 대한 덧글에 대한 네 익명으로 검토, 전쟁 연구 장학금을위한 데이튼 대학원 대학, 그리고 데이턴 생물의 대학 부서 및 TMW에 대한 연구 지원을위한 연구소 (UDRI). 이 작품은 TMW로 미국 심장 협회 부여 11BGIA7280000에 의해 지원되었다.
References
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