Summary
Bizim protokolü bir ev geliştirme mağazasından satın dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kaset ve ucuz malzemeler ile aynı anda birden fazla protein jelleri dökün gösterilmiştir. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C'de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir.
Abstract
Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile proteinlerin değerlendirilmesi biyokimya ve moleküler biyoloji araştırmacılar 1-4 tarafından sıkça kullanılan bir tekniktir. Proteinlerin günlük analizleri gerçekleştirmek için laboratuar, ticari olarak mevcut poliakrilamid jel (~ $ 10/gel) maliyetini önemli bir zaman içinde olabilir. Bu maliyeti azaltmak için, bazı araştırmacılar kendi poliakrilamid jelleri hazırlamak. Bu jellerin dökme Geleneksel yöntemler genellikle özel ekipman ve pahalı olması ve birçok jeller dökme ve gelecekteki kullanım için saklama engel olabilir cam jel plakları kullanmaktadır. Ayrıca, döküm temizleme veya jel sırasında cam plakalar ele lisans laboratuvar derslerinde kendi kullanılmasına engel olabilir, bir güvenlik tehlikesi yaratmak, kazaen kırılması neden olabilir. Bizim protokolü geri dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kasetleri aynı anda birden fazla protein jelleri dökün, ve ucuz ma gösteren nasılterials bir ev geliştirme mağazasından satın. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C'de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir. Ayrıca, plastik jel kasetleri lisans laboratuar sınıfları için ideal hale getiriyor kırılması, son derece dayanıklıdır.
Protocol
1. Kasetleri hazırlanıyor
- Temiz ön ve arka kullanılmış Invitrogen Nupage Novex minigel kaset, veya diğer ticari minigel kaset plakaları.
- Plastik epoksi yaklaşık 1-3 ml hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre iyice karıştırın.
- Kaset monte edildiğinde iki tabak temas edecek ön plaka, iç kenarına epoksi uygulayın.
- Açma kapama aşırı epoksi önlemek için kaset montaj sırasında arka yüzeyinin alt yarık aracılığıyla filtre kağıdı ya da bir karton parçası kaydırarak. Kısa sürede iki tabak monte gibi filtre kağıdı çıkarın.
- Sıkı bir mühür için kenarları boyunca bağlayıcı klipleri yerleştirin ve kasetleri tamamen tedavi etmek için epoksi gece bekletin.
- Elektrik bandı ile arka plaka altındaki yarık sürün.
2. Çözme jel Dökme
- 125 ml yan kol şişesi için aşağıdaki ekleyin:4X Tris-bazlı Ayrıştırıcı jel tampon pH 8.70,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 3.50 ml, Tip 3.25 ml, 2.25 ml 9 ml 'lik bir toplam hacim tepkin madde gradlı I için su (IRG-H2O).
- De-gaz vakum aparatı şişenin yan kol bağlama ve şişenin üstüne ters bir stoper yerleştirerek 10 dakika bir çözüm.
- Bir 50 ml tek kullanımlık polipropilen santrifüj tüpüne de-gassed çözeltisi 9 ml aktarılır ve 30% 10 ammounium persülfat (APS) ile ul ve N ul 6, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED) eklenir ve karıştırılır kabarcıkları tanıtma önlemek için çözüm dönen tarafından iyi.
- Hemen jel plakları arasında meydana gelen herhangi bir kabarcıklarını engellemek için kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset içine çözüm dökün. Ön (daha kısa) plakanın üst kenarından yaklaşık 2 cm ile kaset doldurun.
- Yavaşça 1X çözülmesi jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol ve 0.5 ml ilave jel 1 için polimerize izinsaat.
3. Istifleme jel Dökme
- 4X Tris-bazlı bir istifleme jel tampon pH 6.80,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 0.40 ml, 3 ml 'lik bir toplam hacim için IRG-H2O 1.85 ml, 0.75 ml: bir 125 ml tarafında kolun şişesine aşağıdaki ekleyin.
- De-gazı olarak, adım 2'de açıklandığı 10 dakika süreyle çözeltisi.
- Istifleme jel solüsyonu gaz alma edilirken, çözülmesi jel üst 1X çözme jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol dökünüz. IRG-2 H, O. ile bir kez çözülmesi jeli üstünde durulama Suyu dökün ve kalan sıvı emmek için bir ayyaş ya Whatman filtre kağıdı kullanın.
- Lütfen vakum gazından arındırılmış çözeltisinden 3 ml çıkarın ve% 10 APS ve TEMED 2 ul 9 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
- Hızla kısa ön jel tabakası üst kenarına yakın olduğu kadar kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset çözüm dökün.
- , Jel kaset üst kısmına yerleştirilmiş bir temiz jel tarak eklemebunu tutturmak için tarak üzerinden kaset üzerinde bağlayıcı klip yerleştirin. Istifleme jel gece için 1 saat polimerize edelim.
4. Jel saklama
- Jel tamamen polimerize zaman, bağlayıcı klipleri çıkarın ve ısıl yapışmalı plastik poşet içinde kaset, ya da yeniden yapışmalı plastik torbaya yerleştirin.
- Kese içine% 0,1 sodyum azid içerir 1X istifleme jel tamponu 20 ml dökün.
- 5 saniye çantası mühür ve çanta hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak ısıtın.
- 4 ° C'de jel depolamak
5. Numunelerin Hazırlanması
- Ince duvarlı mikrosantrifüj tüpü, protein numune 6.5 ul, bir 2x Novex Tris-Glisin SDS numune tamponu, 100 mM ditiyotretol (DTT) ve IRG-H 2 O 1 ul (gerekirse) 7.5 ul ekleyebilirsiniz 15 ul toplam hacim.
- Vorteks ile örnek karıştırmak ve kısa bir süre için borunun alt tarafına içeriği getirmek için örnek santrifüjlenir. <li> denatüre 70 ° C Örnek 10 dakika için.
6. Jeli çalıştıran
- Novex jel alet ayarlayın.
- Iç haznesine Nupage antioksidan 500 ul, ve Tris-Glisin dış tamponu çalıştırma odasına 300 ml içeren Tris-Glisin tampon Çalıştırma 200 ml ilave edilir.
- Bir jel yükleme pipet kullanarak kuyulara denatüre protein örneklerinin (15 ul) yükleyin.
- 60-70 dakika 200 V jel çalıştırın.
7. Jel boyama
- Jel cihazdan Kaseti çıkarın ve jel bıçak ya da sert bir spatula kullanarak arayla iki plastik jel plakları meraklı epoksi mühür kırmak. Jel yırtmayın özen, plakalardan jeli dikkatle ayırın.
- IRG-H ile jel nazik ajitasyon ile 2 O üç kere durulanır.
- Nazik ajitasyon ile 1 saat boyunca Invitrogen SimplyBlue SafeStain ile jel leke.
- Boyama çözümü kapalı dökün veIRG-2 H, O. ile jel destain
8. Kasetleri Temizleme
- Tekrar tekrar böylece kasetleri tüm epoksi kazıyarak ya da soyma metal bir spatula kullanın.
- Bir deterjan solüsyonu ile plastik jel plakları her yıkayın ve distile su takip musluk suyu ile iyice durulayın.
9. Temsilcisi Sonuçlar
Epoksi bir su geçirmez sızdırmazlık, (Şekil 1) oluşturacak, çünkü, kaset akrilamid çözeltisi içine döküldü ve bunların olduğunda sızıntı olmayacaktır. Buna ek olarak, jel kasetleri kolayca boyanması için jel almak için açılabilir ve epoksi onların devam yeniden kullanılmasına izin vermek kasetlerinin sıyrılır edilebilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, jel protein belirteçler ve rutin protein elektroforez için uygun örnek gruplarından net ayrım gösterir.
Şekil 1.. Staminigel kasetleri mühürlemek için epoksi katyondur. epoksi ince bir tabaka montajı için önceden kasetleri birinin ucuna uygulanır. Epoksi vurgulamak için, bu görüntü yanlış renkli kırmızı oldu.
Şekil 2. Bir SDS-Tris-glisin jel üzerinde, proteinlerin ayrılması tekrar kullanılabilir minigel kasetleri kullanılarak döküldü. Yukarıda tarif edildiği gibi SDS-PAGE uygulanmıştır. Aşağıdaki elektroforez jel üreticinin talimatlarına göre SimplyBlue SafeStain ile boyanmış minigel kaset, kaldırılır ve aktarılan beyaz ışık kullanılarak fotoğraflandı. Lane M SeeBlue Plus2 öncesi lekeli protein standartları içerir. Şeritli M proteinlerin moleküler ağırlıkları kilodalton (kDa) içinde jel sağ tarafında gösterildiği edilir. Diğer bir şerit glutation-S-transferaz (GST)-etiketli proteini ifade eden bakteriler bir temizlenir lizat proteinleri göstermektedir. Gösterildiği proteinleri g yıkanmış olanlardırGST-etiketli protein elüsyon önce lutathione boncuk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein jel elektroforez en moleküler biyoloji laboratuvarları için vazgeçilmez bir yöntemdir. Piyasada bulunan minigels rahatlık yüksek düzeyde sağlamak, ama pahalıya mal olabilir. Burada ticari minigels popüler bir marka minigel kasetleri yeniden nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu yöntem jellerin hazır bir kaynağı sahip kolaylık korur, ancak ticari minigels maliyetinin bir kısmını. Bu prosedür önemli adımlarından tamamen sızmasını önlemek için unpolymerized akrilamid eklemeden önce kasetleri mühürlemek için epoksi doğru miktarda uyguluyor. Plastik için puan olduğunu, sadece epoksi kullanın ve üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi epoksi polimerizasyonu için yeterli zaman tanıyın. Ekstra rahatlık için, birden fazla kaset mühürlenir ve önceden jel dökme için saklanır. Çözme jel dökme işlemi sırasında, t yüksekliğinden genellikle yaklaşık 0.5 cm daha istifleme jel için yeterli yer bırakmaya dikkat edinkuyuları oluşturmak için kullanılır diye tarak. Çözülmesi jel polimerizasyon sırasında, tampon, doymuş-1-bütanol çözülmesi jel üstünde oluşturmak üzere bir düz, düz yüzey oluştururlar edeceği gibi jel dik tutmak. Jeli 30 dakika içinde polimerize etmezse,% 10 APS ve TEMED miktarı artırılabilir. Jel çalışması bittikten sonra, dikkatle ince jel ripping önlemek için epoksi mühür kırmak için önemlidir. Yöntemi yeniden kullanarak ticari jel kasetleri sık SDS-PAGE kullanımı ile ilgili önemli maliyetleri kaydedebilirsiniz burada bildirdi. Aynı kasetler yıl için yeniden ve biz aynı kaset tekrarlanan kullanımı kullanılabilirliği azaltır dair bir kanıt var olabilir. Buna ek olarak, çoklu jeller% 0.1 sodyum azit içeren 1X istifleme jel tamponu küçük bir miktar ihtiva eden bir polyester bariyer tabakası torbaya hafta için hazırlanmış ve muhafaza edilebilir.
Kısaltmalar:
Ditiyotretol (DTT), N, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED), I distile su (IRG-H2O), ammounium persülfat (APS), sodyum dodesil sülfat (SDS), tris (hidroksimetil) aminometan (Tris-bazlı), N, N'-metilen-bis-akrilamid (bis Tip -akrilamit)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar AH Yaşam ödülü için UF Bilim Howard Hughes Tıp Enstitüsü teşekkür
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
References
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
