Summary
हम एक संयंत्र में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का परीक्षण करने के लिए तकनीक विकसित की है. एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) गैर अतिव्यापी दो टुकड़ों में विभाजित है. प्रत्येक टुकड़ा फ्रेम गेटवे प्रणाली के माध्यम से ब्याज की एक जीन में क्लोन है, संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के. YFP संकेत के पुनर्गठन केवल तब होता है जब तहकीकात प्रोटीन बातचीत.
Abstract
हम एक BiFC vivo में दो प्रोटीनों के बीच बातचीत का परीक्षण करने के लिए तकनीक विकसित की है. यह दो गैर अतिव्यापी टुकड़ों में एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के बंटवारे के द्वारा पूरा किया है. प्रत्येक टुकड़ा फ्रेम ब्याज की एक जीन में क्लोन है. इन constructs तो Agrobacterium मध्यस्थता परिवर्तन के माध्यम से कर सकते हैं Nicotiana benthamiana में सह तब्दील, संलयन प्रोटीन की पारगमन अभिव्यक्ति की अनुमति. YFP संकेत के पुनर्गठन केवल तब होता है जब तहकीकात प्रोटीन 1-7 बातचीत. परीक्षण और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को मान्य करने के लिए, BiFC खमीर दो संकर परख (Y2H) के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अप्रत्यक्ष बातचीत जो Y2H में अनदेखा किया जा सकता का पता लगाने सकता है. गेटवे प्रौद्योगिकी एक सार्वभौमिक मंच है कि ब्याज की जीन (भारत सरकार) के शटल शोधकर्ताओं में सक्षम बनाता है कई अभिव्यक्ति और 8,9 संभव के रूप में कार्यात्मक विश्लेषण प्रणाली के रूप में. दोनों अभिविन्यास और पढ़ने फ्रेम प्रतिबंध एंजाइमों या ligation का उपयोग करने के लिए अभिव्यक्ति तैयार क्लोन बनाने के बिना रखा जा सकता है. एक परिणाम के रूप में, एक पुनः अनुक्रमण कदम प्रयोगों भर में लगातार परिणाम सुनिश्चित समाप्त कर सकते हैं. हम गेटवे संगत BiFC और Y2H वैक्टर जो आसान उपयोग उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं प्रदान दोनों BiFC और Y2H assays 10 प्रदर्शन की एक श्रृंखला बनाई है. यहाँ, हम हमारे BiFC प्रणाली का उपयोग करने के लिए एन में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का परीक्षण करने में आसानी प्रदर्शित benthamiana पौधों.
Protocol
1. Agrobacterium संस्कृति की तैयारी
- Agrobacterium तनाव GV3101 पहले गेटवे संगत BiFC वेक्टर pEarleyGate201 - YC और pEarleyGate202 YN, प्रत्येक युक्त एक संलयन भारत सरकार के निर्माण के साथ बदल दिया .
- BiFC संलयन प्रोटीन का एक 5 मिलीलीटर YEB संस्कृति (5g एल -1 बीफ निकालने, 1g एल -1 खमीर निकालने, 5g एल -1 Peptone, 5g एल -1 Sucrose, 2mm MgSO 4, 7.2 पीएच) टीका लगाना के साथ agrobacterium तब्दील constructs उचित एंटीबायोटिक चयन. 28 में संस्कृति रातोंरात ग्रो · सी 200 rpm पर मिलाते हुए.
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति का एक मिलीलीटर निकालें.
- गोली कोशिकाओं 1,000 g पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- घुसपैठ मीडिया के 1 मिलीग्राम (5 छ एल -1 डी ग्लूकोज, 50 मिमी एमईएस (सिग्मा), मिमी ना 2 3 4 पीओ, 0.1 मिमी acetosyringone) 11 जोड़कर गोली धो लें. द्वारा Resuspend गोली pipetting, 10 मिनट के लिए 1,000 जी पर गोली फिर से कोशिकाओं.
- धोने कदम दो बार दोहराएँ.
- 0.5 मिलीलीटर घुसपैठ मीडिया में गोली Resuspend.
- 600 एनएम absorbance के उपाय और 1,0 600 आयुध डिपो अंतिम 1.2 को समायोजित.
- अशेष भाजक प्रत्येक निर्माण के agrobacterium निलंबन का एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक बराबर राशि, भंवर के लिए 10 सेकंड. घुसपैठ के लिए एक एकल, प्रत्येक निर्माण के 100 μL पर्याप्त से अधिक है.
- agrobacterium मिश्रण अब घुसपैठ के लिए तैयार है .
2. घुसपैठ
- एन benthamiana पौधों को 21 ° C पर 16 घंटे प्रकाश एवं 8 घंटे अंधेरे चक्र के साथ बड़े हो रहे हैं. पांच छह सप्ताह पुराने पौधों को घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- Stomata पूरी तरह खोलने के लिए अनुमति देता है infiltratring 1 ज के लिए सफेद रोशनी के तहत विकास और कमरा जगह से पहले पौधों को हटाएँ.
- सुई के बिना एक 1 मिलीलीटर पर्ची टिप tuberculin सिरिंज में resuspended agrobacterium मिश्रण ड्रा.
- पत्ती के underside के खिलाफ सिरिंज के टिप प्लेस और सवार धीरे दबाना जबकि सीधे एक उंगली से पत्ती की ऊपरी पक्ष का समर्थन. तरल पत्ती के माध्यम से विसरित के रूप में यह mesophyllar हवा के रिक्त स्थान भरता.
- भविष्य में पहचान के लिए एक मार्कर पेन के साथ घुसपैठ क्षेत्र लेबल.
- जब अलग constructs के साथ घुसपैठ, या तो अपने दस्ताने बदलने के लिए या उन्हें घुसपैठ के बीच 70% इथेनॉल के साथ साफ करने के लिए सुनिश्चित करें. यदि संभव हो तो, विभिन्न नमूनों के बीच एक midrib जगह छोड़ पार संदूषण रोकने के.
- एक विकास कैबिनेट में सामान्य वृद्धि की शर्तों के तहत पौधों रखें.
3. पुनर्गठन YFP संकेत अवलोकन
- आबकारी एक 5mm घुसपैठ क्षेत्र के भीतर एक्स पत्ता ऊतक के 5mm खंड
- नमूना, पर्वत, पानी में, एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर, एक coverslip साथ नमूना कवर और एक confocal या प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर बातचीत की जांच.
- अभिव्यक्ति के 5 दिन बाद तक घुसपैठ की समय से हर 24 घंटे की निगरानी करनी चाहिए / अभिव्यक्ति की तस्करी पर फ्लोरोसेंट संलयन एक समय के पाठ्यक्रम पर कई अलग अलग स्थानों प्रदर्शित प्रोटीन के रूप में परिणाम कर सकते हैं.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
BiFC परख द्वारा परीक्षण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. AtTHP1 और AtSAC3A खमीर TREX 2 परिसर के Arabidopsis homolog के घटक माना जाता है. वे एक nuclearporin AtNUP1 के साथ बातचीत कर सकते हैं और mRNA 10 निर्यात की सुविधा. AtTHP1 और AtSAC3A pEarlyGate201 YC में क्लोन किया गया जबकि AtNUP1 pEarlyGate202 - YN में क्लोन किया गया था. constructs बाद में GV3101 में तब्दील हो रहे थे. घुसपैठ के लिए (AtNUP1 AtSAC3A +; AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) तीन constructs 3 संभव संयोजनों के साथ रखा गया है. पुनर्गठन YFP संकेत घुसपैठ के बाद एक LCSM 48 घंटे के तहत मनाया गया. संकेतों epidermal कोशिकाओं में मनाया गया और परमाणु परिधि या परमाणु प्लाज्मा, जो इन प्रोटीनों की उप सेलुलर स्थानीयकरण के साथ संगत है में स्थानीयकृत है. नकारात्मक नियंत्रण किसी भी YFP संकेत नहीं दिखा था.
चित्रा 1 Arabidopsis TREX-2 एन mRNA निर्यात जटिल घटकों एक दूसरे के साथ बातचीत.. benthamiana पत्ते, भारत सरकार के constructs के साथ सह - बदल pEarleyGate201 YC और pEarleyGate202 - YN (के रूप में) संकेत के लिए जुड़े हुए थे घुसपैठ के बाद 48-72 घंटे imaged, Leica टीसीएस SP2 confocol माइक्रोस्कोप का उपयोग . छवियाँ मर्ज किए गए confocal YFP और epidermal एन के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के रूप में दिखाया गया कर रहे हैं benthamiana पत्ता कोशिकाओं
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Discussion
BiFC परख प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. पारंपरिक Y2H परख के विपरीत, BiFC न केवल प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उप सेलुलर स्थानीयकरण के रूप में इस तरह के जटिल प्रोटीन की अधिक जानकारी प्रदान करता है. इसके अलावा, यह संभव है लंबे समय के रूप में अप्रत्यक्ष बातचीत का पता लगाने के रूप में दो उम्मीदवार प्रोटीन एक तीसरे साथी के द्वारा पास पर्याप्त लाया जा. किसी भी तकनीक की तरह, BiFC अपनी सीमाएं हैं. Fluorophore गठन के लिए आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता के कारण, BiFC लाचार anaerobes है, जो ऑक्सीजन की उपस्थिति में नहीं जीवित रह सकते हैं में नहीं किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एरोबिक 6 जीवों के लिए BiFC के उपयोग की सीमा. fluorophore परिसर का गठन अपरिवर्तनीय है. यह दूसरों के साथ बातचीत से प्रोटीन से बचाता है और संघ और गतिशील संतुलन 6 में प्रोटीन परिसरों के विसंघटन को बाधित कर सकते हैं. हालांकि, इस irreversibility भी हमें सक्षम बनाता है कमजोर या पारगमन बातचीत कल्पना है. प्रतिदीप्त प्रोटीन टुकड़े प्रोटीन है जो वे जुड़े हुए हैं के स्वतंत्र सहयोगी के लिए एक सीमित क्षमता है. एक आवश्यक और कई नियंत्रण प्रदान करने के लिए सच है और झूठी सकारात्मक प्रोटीन बातचीत 6 के बीच अंतर करना चाहिए . इसके अलावा, के रूप में fluorophore पुनर्गठन 7nm या अधिक की दूरी पर हो सकता है, प्रतिदीप्ति complementation या तो एक प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत का संकेत हो सकता है. Y2H या सह - immunoprecipitation के रूप में अन्य विधियों का उपयोग करने के लिए सटीक बातचीत रिश्ता 7 का परीक्षण की जरूरत है.
आदेश में विश्वसनीय डेटा उत्पन्न करने के लिए, परिणामों की व्याख्या के लिए उचित नियंत्रण किया जाना चाहिए. खाली वैक्टर सीधे नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा चाहिए के रूप में वे attR1 और attR2 कैसेट के बीच विशिष्ट प्रवेश द्वार टुकड़ा होते हैं. इस प्रकार, इन खाली वैक्टर वास्तव में "खाली" नहीं कर रहे हैं. इस समस्या पर काबू पाने के लिए, हम आम तौर पर असंबंधित वैक्टर करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में जुड़े हुए प्रोटीन की एक जोड़ी का उपयोग करें. एक अन्य संभावित समस्या यह है कि पुराने या जोर दिया पौधों से विशेष रूप से संयंत्र कोशिकाओं से ऑटो प्रतिदीप्ति. अनुभवहीन जांचकर्ताओं पहले uninfiltrated पृष्ठभूमि के साथ परिचित पाने के प्रतिदीप्ति क्षेत्र से एक नमूना पर दिखना चाहिए.
हाल ही में, अधिक BiFC आधारित विधियों करने के लिए आगे प्रोटीन के विभिन्न पहलुओं, शाही सेना, प्रोटीन 12 बातचीत, और डीएनए संकरण 13 BiFC परख के आवेदन का विस्तार करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, बहुरंगा BiFC और BiFC आधारित (BiFC झल्लाहट) झल्लाहट परख की पहचान करने और रहने वाले 14 कोशिकाओं में त्रिगुट परिसरों कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है.
गेटवे और BiFC के संयोजन बरकरार कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत को समझने की मांग शोधकर्ताओं के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हमारी BiFC प्रणाली में प्रयोग किया जाता constructs भी स्थिर ट्रांसजेनिक पौधों को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न ऊतकों में और विभिन्न विकासात्मक चरणों जो क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली में नहीं देखा जा सकता है और अधिक गतिशील प्रोटीन बातचीत कल्पना इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक हा टैग और हमारे BiFC वैक्टर में एक झंडा टैग (pEarleyGate201 YC और pEarleyGate202 - YN) को शामिल किया है, क्रमशः. इस संशोधन पश्चिमी सोख्ता, सह immunoprecipitation और आत्मीयता शुद्धि, आदि जैसे विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों के लिए बातचीत के दृश्य के बाद, यह संभव बनाता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि और सामान्य प्रयोगशाला सहायता पढ़ने के लिए Vi गुयेन धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
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