Summary
פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.
Abstract
פיתחנו טכניקה BiFC לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים in vivo. מטרה זו מושגת על ידי פיצול חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לשני שברים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן של עניין. מבנים אלה אז יכול להיות שותף להפוך ניקוטיאנה benthamiana דרך טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium, המאפשר ביטוי במעבר של חלבונים היתוך. הכינון מחדש של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה 1-7. כדי לבדוק ולאמת את חלבונים אינטראקציות, BiFC ניתן להשתמש יחד עם שני assay שמרים (Y2H) היברידית. זה יכול לזהות אינטראקציות עקיף אשר ניתן להתעלם ב Y2H. הטכנולוגיה Gateway היא פלטפורמה אוניברסאלית המאפשרת לחוקרים המעבורת הגן של עניין (GOI) לתוך כביטוי רבים מערכות אנליזה פונקציונלית כמו 8,9 אפשרי. גם הכיוון ואת מסגרת הקריאה יכול להישמר ללא שימוש אנזימי הגבלה או קשירת להפוך מוכנים ביטוי שיבוטים. כתוצאה מכך, אפשר לחסל את כל סידור מחדש של צעדים כדי להבטיח תוצאות עקביות לאורך הניסויים. יצרנו סדרה של וקטורים BiFC תואם Gateway ו Y2H אשר לספק לחוקרים עם קל להשתמש בכלים כדי לבצע מבחני הן BiFC ו Y2H 10. כאן, אנו להדגים את קלות השימוש במערכת BiFC שלנו לבדוק חלבונים אינטראקציות נ benthamiana צמחים.
Protocol
1. הכנת תרבות Agrobacterium
- Agrobacterium זן GV3101 שינתה בעבר עם Gateway תואם BiFC וקטור pEarleyGate201-י"ס pEarleyGate202 ו-YN, שכל אחת מהן מכילה היתוך לבנות של GOI.
- לחסן 5 מ"ל ייב (5 גרם ל -1 תמצית בשר בקר, 1g ל -1 תמצית שמרים, 5 גרם ל -1 Peptone, 5g סוכרוז ל -1, 2 מ"מ MgSO 4, pH 7.2) תרבות של חלבון היתוך BiFC בונה הפך Agrobacterium עם מבחר אנטיביוטי מתאים. לגדול בתרבות לילה בשעה 28 ° C רועד ב 200 סל"ד.
- הסרה של 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.5 מ"ל.
- תאים גלולה ב g 1000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, להשליך supernatant.
- שטפו את הכדור על ידי הוספת 1 מ"ל של התקשורת הסתננות (5 גרם ל -1 D-גלוקוז, 50 מ"מ MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0.1 mM acetosyringone) 11. Resuspend גלולה ידי pipetting, תאים גלולה שוב גרם 1000 עבור 10 דקות.
- חזור על השלב לשטוף פעמיים נוספות.
- Resuspend גלולה ב 0.5 התקשורת חדירה מ"ל.
- מדוד את ספיגת ב 600 ננומטר ולהתאים הסופי OD 600-1.0 to 1.2.
- Aliquot סכום השווה ההשעיה Agrobacterium של כל לבנות לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש, מערבולת עבור 10 שניות. עבור חדירה אחת, 100 μL של כל לבנות די והותר.
- תערובת Agrobacterium מוכן כעת חדירה.
2. הסתננות
- נ 'מפעלי benthamiana גדלים ב 21 מעלות צלזיוס, עם אור 16-H & 8-h מחזורים כהה. חמש לצמחים שישה שבועות בן אמור לשמש הסתננות.
- הסר צמחים מחדר צמיחה מקום תחת אור לבן על h 1 לפני infiltratring המאפשר הפיוניות כדי לפתוח באופן מלא.
- צייר את תערובת Agrobacterium resuspended בתוך מזרק 1 מ"ל טוברקולין להחליק, ללא קצה המחט.
- הניחו את קצה המזרק נגד התחתון של העלה בעדינות לוחץ על המתג תוך ישירות התומכות בצד העליון של העלה באצבע אחת. הנוזל יהיה לנטרל באמצעות עלה כפי שהוא ממלא את החללים אוויר mesophyllar.
- לייבל באזור הסתננו עם עט סמן לזיהוי בעתיד.
- כאשר חדירה עם מבנים שונים, הקפד לשנות או כפפות או לנקות אותם עם אתנול 70% בין חדירות. אם אפשר, להשאיר מקום אחד midrib בין מדגמים שונים כדי למנוע זיהום צולבות.
- מקום צמחים בארון צמיחה בתנאים צמיחה נורמלית.
3. תצפית של האות YFP מחדש
- קטע והבלו 5mm x 5mm של רקמת העלה בתוך אזור חדרה
- הר המדגם, במים, בשקופית מיקרוסקופ זכוכית, מכסים את המדגם עם coverslip ולבחון את יחסי הגומלין באמצעות מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי.
- הביטוי צריך להיות במעקב כל 24 שעות מרגע החדירה עד 5 ימים מאוחר יותר על הביטוי / בסחר עלולה לגרום חלבונים היתוך ניאון הצגת במקומות שונים לאורך זמן.
4. נציג תוצאות:
דוגמה של אינטראקציה בין חלבונים נבדק על ידי assay BiFC מוצג באיור 1. AtTHP1 ו AtSAC3A הם האמינו להיות מרכיבי homolog ארבידופסיס של מורכבות שמרים-2 זבל. הם יכולים לקיים אינטראקציה עם AtNUP1 nuclearporin ולאפשר יצוא mRNA 10. AtTHP1 ו AtSAC3A היו משובטים לתוך pEarlyGate201-י"ס תוך AtNUP1 היה משובטים לתוך pEarlyGate202-YN. בונה הפכו לאחר מכן לתוך GV3101. שלושת המבנים היו לזווג אותו עם 3 הצירופים האפשריים (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) עבור חדירה. האות מחדש YFP נצפתה תחת LCSM 48 שעות לאחר החדירה. האותות נצפו תאים אפידרמיס ומקומיות בפריפריה גרעיני או פלזמה גרעיני, אשר עולה בקנה אחד עם לוקליזציה המשנה הסלולר של החלבונים האלה. שולט שלילי לא הראה שום סימן YFP.
באיור 1. ארבידופסיס Trex-2-mRNA יצוא רכיבים מורכבים לתקשר אחד עם השני. נ benthamiana עלים, שיתוף שינה עם המבנים של GOI התמזגו pEarleyGate201-י"ס pEarleyGate202 ו-YN (כפי שצוין), הם צילמו 48-72 שעות לאחר החדירה, באמצעות מיקרוסקופ הלייקה TCS SP2 confocol. תמונות מוצגים YFP confocal הממוזג בהיר בשדה תמונות של אפידרמיס נ benthamiana עלה תאים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay BiFC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון. בניגוד assay Y2H המסורתית, BiFC לא רק מאפשר הדמיה של חלבונים אינטראקציות, אלא גם מספק מידע יותר מורכב החלבון כגון בלוקליזציה המשנה הסלולר. כמו כן, ניתן לזהות אינטראקציות עקיפה, כל עוד שני חלבונים מועמד אפשר להביא מספיק קרוב על ידי שותף שלישי. כמו כל טכנולוגיה, BiFC יש מגבלות. בשל הדרישה של חמצן מולקולרי ליצירת fluorophore, BiFC לא ניתן להשתמש אנאירוביים לחייב, אשר לא יכולים לשרוד בנוכחות חמצן. זה מגביל את השימוש BiFC אורגניזמים אירוביים 6. היווצרות קומפלקס fluorophore הוא בלתי הפיך. הדבר מונע מן אינטראקציה עם חלבונים אחרים ועלול לשבש את העמותה התפוררותו של קומפלקסים חלבונים בשיווי משקל דינמי 6. עם זאת, הפיכות זה גם מאפשר לנו לחזות אינטראקציות חלשות או מעבר. שברי חלבון פלואורסצנטי יש יכולת מוגבלת עמית עצמאי של חלבונים שאליו הם התמזגו. צריך לספק את הפקדים הדרושים רבים להבחין בין אינטראקציות חלבון אמת ושקר חיובי 6. כמו כן, הכינון מחדש fluorophore יכול להתרחש במרחק של 7nm או יותר, השלמה הקרינה עשויה להצביע גם אינטראקציה ישירה או עקיפה. אחד צריך להשתמש בשיטות אחרות כגון Y2H או Co-immunoprecipitation לבחון את מערכת היחסים האינטראקציה המדויק 7.
על מנת להפיק נתונים אמין, שולטת תקין אמור לשמש הפרשנות של התוצאות. וקטורים ריק אין להשתמש ישירות כפקדי כפי שהם מכילים שבר שער טיפוסי בין attR1 ו attR2 קלטות. לפיכך, אלה וקטורים ריק הם לא באמת "ריק". כדי להתגבר על בעיה זו, אנו משתמשים בדרך כלל זוג של חלבונים שאינם קשורים התמזגו עם וקטורים כביקורת. בעיה נוספת היא פוטנציאל אוטומטי לזרוח מתאי צמחים, בעיקר מצמחים זקן או לחוץ. חוקרים מנוסים צריך קודם להסתכל על מדגם מאזור uninfiltrated להכיר את הרקע לזרוח.
לאחרונה, שיטות יותר BiFC מבוססי פותחו כדי להרחיב את היישומים של assay BiFC להיבטים שונים של חלבונים, RNA אינטראקציות חלבון 12, הכלאה DNA 13. לדוגמה, ססגוניות BiFC ו BiFC מבוססי סריג (BiFC-סריג) assay פותחו כדי לזהות לדמיין מתחמי משולשת בתאים חיים 14.
השילוב של Gateway ו BiFC הוא כלי רב עוצמה עבור חוקרים המבקשים להבין אינטראקציות חלבון בתאים שלמים. בונה השתמשו במערכת BiFC שלנו יכול לשמש גם ליצירת צמחים הטרנסגניים יציב לדמיין אינטראקציות חלבון דינמי יותר ברקמות שונות בשלבים התפתחותיים שונים אשר לא ניתן לצפות במערכת ביטוי חולף. אנחנו שילבו תג ותג HA הדגל וקטורים BiFC שלנו (pEarleyGate201-י"ס pEarleyGate202 ו-YN), בהתאמה. שינוי זה מאפשר ליישומים שונים, כגון הזרם immunoprecipitation עמית המערבי סופג, וטיהור זיקה וכו ', לאחר להדמיה של האינטראקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים וי נגוין לקרוא את כתב היד וסיוע מעבדה כללית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
