Summary
Мы разработали методику для тестирования белок-белковых взаимодействий в растение. Желтый флуоресцентный белок (YFP) расщепляется на два непересекающихся фрагментов. Каждый фрагмент клонировали в рамке интересующего гена через шлюз системы, что позволяет выражение плавления белков. Восстановление сигнала YFP только тогда, когда следствие белки взаимодействуют.
Abstract
Мы разработали BiFC технику для проверки взаимодействия двух белков в естественных условиях. Это достигается за счет расщепления желтый флуоресцентный белок (YFP) на два непересекающихся фрагментов. Каждый фрагмент клонировали в рамке гена. Эти конструкции могут быть совместно преобразован в Nicotiana benthamiana через преобразование опосредованной Agrobacterium, что позволяет транзитным выражение плавления белков. Восстановление сигнала YFP только тогда, когда следствие белки взаимодействуют 1-7. Для проверки и подтверждения белок-белковых взаимодействий, BiFC могут быть использованы вместе с дрожжами два гибридных (Y2H) анализа. Это может обнаружить косвенные взаимодействия, которые могут быть пропущены в Y2H. Шлюз технология является универсальной платформой, которая позволяет исследователям трансфер интересующего гена (ГОИ) на столько экспрессии и функциональные системы анализа в качестве возможных 8,9. Обе ориентации и рамки считывания может быть обеспечена без использования ферментов рестрикции или лигирования, чтобы выражения готовых клонов. В результате, один может устранить все заново последовательность шагов для обеспечения последовательного результаты на протяжении всего эксперимента. Мы создали серию шлюзов совместимы векторов BiFC и Y2H которые предоставляют исследователям с помощью простых в использовании инструментов для выполнения как BiFC и Y2H анализов 10. Здесь мы демонстрируем, простота использования наших BiFC комплекс для тестирования белок-белковых взаимодействий в Н. benthamiana растений.
Protocol
1. Подготовка культурой Agrobacterium
- Agrobacterium штамма GV3101 ранее трансформированных шлюз совместимы BiFC вектор pEarleyGate201-YC и pEarleyGate202-Ю.Н., каждый из которых содержит слияние построить ГОИ.
- Привить 5-мл YEB (5 г L -1 Мясной экстракт, 1 г L -1 дрожжевого экстракта, 5 г L -1 пептон, 5 г L-1 Сахароза, 2 мМ MgSO 4, рН 7,2) культуры BiFC слитого белка конструкции превращаются Agrobacterium с соответствующий антибиотик выбора. Рост культуры в течение ночи при 28 ° C, встряхивая при 200 оборотах в минуту.
- Удалить 1 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку 1,5 мл.
- Гранул клеток в 1000 г в течение 10 мин при комнатной температуре, отбросить супернатант.
- Вымойте гранул путем добавления 1 мл инфильтрации СМИ (5 г L-1 D-глюкозы, 50 мМ MES (Sigma), 2 мМ Na 3 PO 4, 0,1 ммоль acetosyringone) 11. Ресуспендируют гранул с помощью пипетки, пеллет клетки снова в 1000 г в течение 10 мин.
- Повторите мыть шаг еще два раза.
- Ресуспендируют гранулы в 0,5 мл среды инфильтрации.
- Измерить абсорбцию при 600 нм и настроить окончательный диаметр от 600 до 1,0 до 1,2.
- Алиготе равное количество Agrobacterium приостановлении каждой конструкции в новый 1,5 мл трубки, вихревые на 10 сек. Для одного инфильтрация, 100 мкл каждой конструкции более чем достаточно.
- Смесь Agrobacterium готов к инфильтрации.
2. Инфильтрация
- Н. benthamiana растения выращивают при 21 ° С, с 16-ч света и 8-ч темно циклов. Пять-шесть-недельных растений следует использовать для проникновения.
- Удалите растения из комнаты роста и место под белым светом за 1 ч до infiltratring позволяет устьица полностью открыты.
- Составить ресуспендировали Agrobacterium смеси в 1-мл скольжения наконечника шприца туберкулин без иглы.
- Место кончике шприца против нижней стороне листа и аккуратно нажмите на поршень в то время как непосредственную поддержку верхней стороне листа с одним пальцем. Жидкости будет диффундировать через лист, как он заполняет mesophyllar воздушного пространства.
- Этикетка проникли области с маркером для будущей идентификации.
- При проникающих с различными конструкциями, убедитесь, что либо изменить перчатки и убрать их с 70% этанола между проникновения. Если это возможно, оставить один жилки пространство между различными образцами, чтобы предотвратить перекрестное заражение.
- Место растений в росте кабинета при нормальных условиях роста.
3. Наблюдение восстановленного сигнала YFP
- Акцизный 5 мм х 5 мм сегмент ткани листа в зону проникли
- Горы образца, в воде, на микроскопический слайд стекла, крышка образца с покровным и изучить взаимодействий с использованием конфокальной или флуоресцентного микроскопа.
- Выражение должно контролироваться каждые 24 часов с момента проникновения до 5 дней позже, как за выражение / торговля может привести к флуоресцентных белков слияния отображения нескольких разных местах за время курса.
4. Представитель Результаты:
Например белок-белковых взаимодействий проверены BiFC анализа показано на рисунке 1. AtTHP1 и AtSAC3A как полагают, являются компонентами Arabidopsis гомолог дрожжей TREX-2 комплекса. Они могут взаимодействовать с nuclearporin AtNUP1 и облегчения экспорта мРНК 10. AtTHP1 и AtSAC3A были клонированы в pEarlyGate201-YC в то время как AtNUP1 клонировали в pEarlyGate202-уп. Конструкции впоследствии были преобразованы в GV3101. Три конструкции были в паре с 3 возможных комбинаций (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) для инфильтрации. Восстановленного сигнала YFP наблюдалась в LCSM 48 часов после проникновения. Сигналы наблюдались в клетки эпидермиса и локализованный в периферии ядра или ядерной плазмы, которая согласуется с субклеточные локализации этих белков. Отрицательный контроль не показали YFP сигнала.
Рисунок 1. Arabidopsis TREX-2 мРНК экспорта сложные компоненты взаимодействуют друг с другом. Н. benthamiana листьев, со-трансформированных конструкций ГОИ, слитый с pEarleyGate201-YC и pEarleyGate202-YN (как указано), были обследованы 48-72 ч после проникновения, используя Leica TCS SP2 confocol микроскопом. Изображения отображаются в виде объединены конфокальной YFP и светлого поля изображения эпидермального Н. benthamiana клетках листа
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC анализ является мощным инструментом для изучения белковых взаимодействий. В отличие от традиционного анализа Y2H, BiFC не только позволяет визуализировать белок-белковых взаимодействий, но также предоставляет дополнительную информацию из белкового комплекса, таких как субклеточные локализации. Кроме того, можно обнаружить косвенные взаимодействия тех пор, пока два белка кандидата могут быть привлечены достаточно близко от третьего партнера. Как и любая технология, BiFC имеет свои ограничения. В связи с требованием молекулярного кислорода для флуорофора образования, BiFC не могут быть использованы в облигатных анаэробов, которые не могут выжить в присутствии кислорода. Это ограничивает использование BiFC для аэробных организмов 6. Образования флуорофора комплекса является необратимым. Это предотвращает белков, взаимодействующих с другими и может нарушить ассоциации и диссоциации белковых комплексов в динамическом равновесии 6. Однако, это необратимость также позволяет визуализировать слабые или транзита взаимодействий. Флуоресцентный протеин фрагменты обладают ограниченной способностью связывать независимо от белков, к которым они слиты. Надо обеспечить необходимый контроль и многочисленные различать истинные и ложные-положительных белковых взаимодействий 6. Кроме того, как флуорофор восстановление может произойти на расстоянии 7нм или более, флуоресценция дополнения может указывать либо прямое или косвенное взаимодействие. Нужно использовать и другие методы, такие как Y2H или Со-Иммунопреципитация проверить точное соотношение взаимодействия 7.
В целях получения достоверных данных, надлежащего контроля должны быть использованы для интерпретации результатов. Пустые векторы не должны быть непосредственно использованы в качестве контроля, поскольку они содержат типичный фрагмент шлюз между attr1 и attr2 кассет. Таким образом, эти пустые векторов на самом деле не "пустые". Чтобы преодолеть эту проблему, мы обычно используем пары не связанных между собой белки, слитый с векторами в качестве контроля. Другой потенциальной проблемой является автоматическим флуоресцируют из растительных клеток, особенно из старых или подчеркнул растений. Неопытные исследователи должны сначала посмотреть на образец из uninfiltrated зону, чтобы ознакомиться с фоном флуоресцировать.
В последнее время все BiFC основе были разработаны методы для дальнейшего расширения применения BiFC анализа различных аспектов белки, РНК-белковых взаимодействий 12 и гибридизации ДНК 13. Например, многоцветная BiFC и BiFC основе FRET (BiFC-FRET) анализа были разработаны с целью выявления и визуализации тройных комплексов в живых клетках 14.
Сочетание шлюз и BiFC является мощным инструментом для исследователей, стремящихся понять белковых взаимодействий в неповрежденных клетках. Конструкций, используемых в нашей BiFC система может также использоваться для генерации стабильного трансгенных растений для визуализации более динамичным белковых взаимодействий в различных тканях и на разных стадиях развития, которые не могут наблюдаться в переходной системе выражения. Мы включили HA теги и теги FLAG в нашей BiFC векторов (pEarleyGate201-YC и pEarleyGate202-Ю.Н.), соответственно. Эта модификация позволяет для различных вниз по течению приложений, таких как западная промокательной, Со-Иммунопреципитация и аффинной очистки и т.д., после визуализации взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны В. И. Нгуен за чтение рукописи и общую помощь лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
