Summary
Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.
Abstract
Biz, in vivo olarak iki protein arasındaki etkileşimi test etmek için bir BiFC tekniği geliştirdik . Bu örtüşmeyen iki parçalara bölme sarı floresan protein (YFP) tarafından gerçekleştirilir. Her parçası ilgi bir gen-frame klonlanmış. Bu yapılardan sonra, füzyon proteinleri transit ifade izin Agrobacterium aracılı dönüşüm yoluyla Nicotiana benthamiana içine ortak dönüştürülmüş olabilir. YFP sinyal sulandırıldıktan sadece tahkikat proteinleri 1-7 etkileşime girdiğinde oluşur. BiFC protein-protein etkileşimleri test etmek ve doğrulamak için, maya iki hibrid (Y2H) tayini ile birlikte kullanıldığında olabilir. Bu Y2H göz ardı edilebilir dolaylı etkileşimleri algılayabilir. Ağ Geçidi teknoloji, servis ilgi gen (GOI) araştırmacıları, evrensel bir platformda pek çok ifade ve mümkün 8,9 olarak fonksiyonel analiz sistemleri. Her iki yönelim ve okuma çerçevesini ifade hazır klonları yapmak için restriksiyon enzimleri veya ligasyonu kullanmadan muhafaza edilebilir. Sonuç olarak, bir deneyler boyunca tutarlı sonuçları elde etmek için yeniden sıralama adımları ortadan kaldırabilir. Biz, hem de BiFC ve Y2H testleri gerçekleştirmek için 10 kolay kullanımlı araçları ile araştırmacılara Ağ Geçidi uyumlu BiFC ve Y2H vektörler bir dizi oluşturduk . Burada, N. protein-protein etkileşimleri test etmek için BiFC sistemini kullanarak kolaylığı göstermek benthamiana bitkiler.
Protocol
1. Agrobacterium kültür hazırlanması
- Agrobacterium suşu GV3101 önceden Ağ Geçidi uyumlu BiFC vektör pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN, her bir füzyon GOI inşa içeren ile değiştirdi.
- BiFC füzyon proteini bir 5 ml YEB (5g L -1 Sığır özü, 1g L -1 Maya özü, 5g L -1 Peptonlu, 5g L -1 Sakkaroz, 2mm MgSO 4, pH 7,2) kültür İnokülasyon ile Agrobacterium dönüştürülmüş yapıları uygun antibiyotik seçimi. 28 gecede kültür büyütün ° C 200 rpm'de sallayarak.
- 1,5 ml steril bir santrifüj tüpüne 1 ml kültür çıkarın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika için 1.000 g Pelet hücreleri, supernatant atın.
- 1 ml (5 g L-1, D-glukoz, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0.1 mM acetosyringone) 11 infiltrasyon medya ekleyerek pelet yıkayın . Pipetleme tarafından süspanse edin pelet, 10 dakika tekrar 1.000 g pelet hücreleri.
- Yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın.
- 0.5 ml sızma medya pelletini tekrar.
- 600 nm'de absorbansı ölçülür ve 1,2-1,0 OD 600 son ayarlayabilirsiniz.
- Yeni bir 1.5 ml tüp içine eşit miktarda her yapının Agrobacterium süspansiyon, 10 sn için vorteks kısım. Tek bir infiltrasyon için, her yapının 100 mcL fazlasıyla yeterli.
- Agrobacterium karışımı infiltrasyon için hazırdır.
2. Sızma
- N. benthamiana tesisleri, 21 ° C'de 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngüleri yetiştirilmektedir. Beş altı hafta eski bitkiler infiltrasyon için kullanılmalıdır.
- 1 saat için beyaz ışık altında büyüme odası ve yerden bitkilerin stoma tamamen açmak için izin infiltratring önce çıkarın.
- 1 ml kayma ucu tüberkülin şırınga, iğne olmadan yeniden süspanse Agrobacterium karışımı hazırlayın .
- Yaprağın alt karşı şırınga ucu yerleştirin ve üst tarafında bir parmak yaprak doğrudan destek verirken pistonu hafifçe bastırın. Mesophyllar hava boşlukları doldurur gibi sıvı yaprak yoluyla yayılır.
- Gelecekte kimlik için bir marker kalem ile infiltre alan etiketleyin.
- Farklı yapıları ile infiltre, eldiven değiştirmek veya sızıntıların arasında% 70 etanol ile temizleyin ya da emin olun. Mümkünse, farklı örnekleri arasında çapraz bulaşmayı önlemek için tek bir yaprak orta damarı boşluk bırakın.
- Normal büyüme koşulları altında bir büyüme kabine bitkiler yerleştirin.
3. Sulandırılmış YFP sinyal Gözlem
- Vergi bir yaprak doku infiltre bölgesi içinde 5mm x 5mm segmenti
- Su, cam bir mikroskop lamı üzerine bir lamel ile örnek kapak ve konfokal veya floresan mikroskobu kullanarak etkileşimleri incelemek, örnek monte edin.
- Ifade / ticareti üzerinde bir süre boyunca pek çok farklı yerlerde gösteren floresan füzyon proteinleri neden olabilir İfade, 5 gün sonra infiltrasyon zaman her 24 saatte bir kontrol edilmelidir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
BiFC tahlil tarafından test protein-protein etkileşim bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. AtTHP1 ve AtSAC3A maya TREX-2 kompleks Arabidopsis homolog bileşenleri olduğuna inanılmaktadır. Nuclearporin AtNUP1 ile etkileşim ve mRNA ihracatı 10 kolaylaştırabilir. AtNUP1 pEarlyGate202-YN klonlanmış iken AtTHP1 ve AtSAC3A pEarlyGate201-YC klonlanmış. Yapıları daha sonra GV3101 dönüştü. Infiltrasyonu (AtNUP1 + AtSAC3A; AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) üç yapıları 3 olası kombinasyonları ile eşleştirilmiş edildi. Infiltrasyon sonra LCSM 48 saatin altında sulandırılmış YFP sinyal gözlendi. Sinyalleri epidermal hücrelerinde gözlenen ve bu proteinlerin alt hücresel yerleşimi ile tutarlı olan nükleer çevre veya nükleer plazma, lokalize edildi. Negatif kontroller, herhangi bir YFP sinyal vermedi.
Şekil 1 Arabidopsis TREX-2 mRNA ihracat karmaşık bileşenlerin birbirleri ile etkileşim N. benthamiana yapraklar, Leica TCS SP2 confocol mikroskop kullanarak GOI kurgular ile birlikte dönüştürülmüş 48-72 saat sonra, sızma görüntülü, pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN (belirtildiği gibi) erimiş. Görüntüler birleştirilmiş konfokal YFP ve epidermal N. parlak alan görüntüler olarak gösterilir. benthamiana yaprak hücreleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC tahlil protein etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. BiFC geleneksel Y2H testinin aksine, sadece protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda alt hücresel yerleşimi gibi protein kompleksi daha fazla bilgi sağlar. Ayrıca, iki aday proteinler üçüncü bir ortağı tarafından yeterince yakın getirilebilir olarak sürece dolaylı etkileşimleri tespit etmek mümkündür. Herhangi bir teknoloji gibi, BiFC sınırlamaları vardır. BiFC fluorofor oluşumu için moleküler oksijen gereksinimi nedeniyle, oksijen varlığında yaşayamaz zorunlu anaeroblar, kullanılabilir değildir. Bu aerobik organizmalar 6 BiFC kullanımı sınırlamaktadır. Fluorofor kompleks oluşumu geri döndürülemez. Bu başkaları ile etkileşim proteinler önler ve dinamik denge 6 protein kompleksleri dernek ve disassociation bozabilir. Ancak, bu tersinmezlik zayıf veya transit etkileşimleri de görselleştirmek için bize sağlar. Floresan protein parçaları, erimiş olan proteinlerin bağımsız ilişkilendirmek için sınırlı bir yeteneği var. Bir, doğru ve yanlış pozitif protein etkileşimleri 6 arasındaki farkı ayırt etmek gerekli ve çok sayıda kontrol sağlaması gerekir . Ayrıca, fluorofor sulandırıldıktan 7nm veya daha fazla bir mesafe oluşabilir, floresan tamamlama ya doğrudan ya da dolaylı etkileşim gösterebilir. Bir tam bir etkileşim ilişkisi 7 test etmek için, Y2H veya Co-Immunoprecipitation gibi diğer yöntemleri kullanmak gerekiyor .
Güvenilir veri oluşturmak amacıyla, uygun kontrol sonuçlarının yorumlanması için kullanılmalıdır. AttR1 ve attR2 kasetler arasında tipik bir ağ geçidi parçası içeren boş vektörleri doğrudan kontrol olarak kullanılan olmamalıdır. Bu nedenle, bu boş vektörler gerçekten "boş" değildir. Bu sorunu aşmak için, biz genel bir kontrol gibi vektörlerin erimiş ilgisiz proteinlerin bir çift kullanın. Bir diğer potansiyel sorun, özellikle eski ya da vurguladı bitkilerden elde bitki hücreleri, oto-floresan. Deneyimsiz araştırmacılar ilk uninfiltrated bölgesinden floresan arka plan ile tanımak için bir örnek bakmak gerekir.
Son zamanlarda, daha fazla BiFC tabanlı yöntemler, daha çeşitli yönleriyle proteinlerin, 12 RNA-protein etkileşimleri, ve DNA hibridizasyon 13 BiFC testinin uygulamaları genişletmek için geliştirilmiştir. Örneğin, çok renkli BiFC ve BiFC tabanlı, canlı hücreler 14 üçlü kompleksler tanımlamak ve görselleştirmek için geliştirilmiştir (BiFC FRET) tahlil FRET .
Gateway ve BiFC arada sağlam hücreler protein etkileşimleri anlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir araçtır. Bizim BiFC sistemde kullanılan yapıları da farklı dokularda ve geçici ekspresyon sistemi gözlenen olmayabilir çeşitli gelişim aşamalarında daha dinamik bir protein etkileşimleri görselleştirmek için istikrarlı transgenik bitkiler oluşturmak için kullanılabilir. Biz sırasıyla BiFC vektörler HA etiketi ve BAYRAK etiketi (pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN) dahil etmişlerdir. Bu değişiklik etkileşimlerin görselleştirme sonra, batı blot, Co-Immunoprecipitation ve yakınlık arıtma, vb gibi çeşitli alt uygulamalar için mümkün kılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Vi Nguyen Biz el yazması ve genel laboratuvar yardım okuma için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
