Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.
Acetaat kinase, een lid van de acetaat en suiker kinase-Hsp70-actine (ASKHA) enzym superfamilie 1-5, is verantwoordelijk voor de reversibele fosforylering van acetaat tot acetyl fosfaat gebruik te maken van ATP als een substraat. Acetaat kinases zijn alomtegenwoordig in de bacteriën, gevonden in een genus van de Archaea, en zijn ook aanwezig in microben van de Eukarya 6. De meest gekarakteriseerd acetaat kinase is dat vanaf het methaan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Een acetaat kinase die alleen gebruik kunnen maken van PP-i, maar niet ATP in de acetyl fosfaat-vormende richting is geïsoleerd van Entamoeba histolytica, de verwekker van amoeben dysenterie, en heeft tot nu toe alleen gevonden in dit genus 15,16.
In de richting van acetyl fosfaat formatie, is acetaat kinase-activiteit meestal gemeten met behulp van de hydroxamaat test, het eerst beschreven door Lipmann17-20, een gekoppelde test waarin de omzetting van ATP naar ADP is gekoppeld aan oxidatie van NADH tot NAD + door de enzymen pyruvaatkinase en lactaat dehydrogenase 21,22, of een test meet release van anorganisch fosfaat na reactie van de acetyl-fosfaat product met hydroxylamine 23. Activiteit in het tegenovergestelde, is acetaat-vormende richting gemeten door de koppeling van ATP vorming van ADP tot de reductie van NADP + om NADPH door de enzymen hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase 24.
Hier beschrijven we een methode voor de detectie van acetaat kinase-activiteit in de richting van acetaat formatie die niet nodig koppeling enzymen, maar in plaats daarvan is gebaseerd op directe bepaling van de acetyl fosfaat consumptie. Na de enzymatische reactie neemt het resterende acetyl fosfaat omgezet in een ijzer hydroxamaat complex, dat spectrofotometrisch kan worden, gemeten als voor de hydroxamaat test. Dus, in tegenstelling tot de standard gekoppeld test voor deze richting, dat is afhankelijk van de productie van ATP uit ADP, kan dit direct assay worden gebruikt voor acetaat kinases die ATP of PP i te produceren.
De detectie van acetyl fosfaat in deze test is afhankelijk van een voldoende concentratie van hydroxylamine hydrochloride en de concentratie en zuurgraad van de ijzerchloride-oplossing. Wijziging van de test volume vereist heroverweging van beide componenten. De enzymatische reacties die hier beschreven werden uitgevoerd bij 37 ° C met de hydroxylamine beëindiging uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 5 minuten. Deze hogere temperatuur is van cruciaal belang om voor een snelle conversie van de resterende acetyl fosfaat naa…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NSF award # 0920274 en South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) aan KSS. Dit papier is technische bijdrage No 5929 van de Clemson University Experiment Station.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |