Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.
Quinase acetato, um membro do acetato e-quinase Hsp70-actina açúcar superfamília de enzimas (ASKHA) 1-5, é responsável pela fosforilação reversível de acetato de acetil fosfato ATP, utilizando como substrato. Acetato de quinases são onipresentes na bactéria, encontrada em um gênero de Archaea, e também estão presentes em micróbios da Eukarya 6. O acetato quinase mais bem caracterizado é que a partir do metano produzindo archaeon Methanosarcina thermophila 14/07. Uma quinase de acetato, que só pode utilizar PP i ATP, mas não na direção do acetil-fosfato formando foi isolado de Entamoeba histolytica, o agente causador da disenteria amebiana, e até agora só foi encontrado nesta 15,16 gênero.
Na direção da formação de fosfato de acetil, acetato de atividade da quinase é normalmente medido utilizando o ensaio de hidroxamato, primeiramente descrita por Lipmann17-20, um ensaio acoplado em que a conversão de ATP a ADP é acoplada a oxidação de NADH para NAD + pela enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase 21,22, ou um ensaio de medição de liberação de fosfato inorgânico após a reação do produto acetil fosfato com hidroxilamina 23. Atividade no lado oposto, o acetato de formação de sentido é medida pelo acoplamento formação de ATP a partir de ADP para a redução do NADP + a NADPH pela hexoquinase enzimas e glicose 6-fosfato desidrogenase 24.
Aqui nós descrevemos um método para a detecção de atividade de acetato quinase na direção da formação de acetato de que não necessita de enzimas de acoplamento, mas em vez disso é baseada na determinação direta do consumo de fosfato de acetila. Após a reação enzimática, permanecendo acetil fosfato é convertido em um complexo hidroxamato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente, como para o ensaio hidroxamato. Assim, ao contrário do stensaio acoplado andard para esta direcção, que é dependente da produção de ATP a partir de ADP, este ensaio direto podem ser utilizados para quinases acetato que produzem ATP ou PP i.
A detecção de fosfato de acetil neste ensaio é dependente de uma concentração suficiente de cloridrato de hidroxilamina, e da concentração e da acidez da solução de cloreto férrico. Alteração do volume de ensaio requer a reconsideração de ambos os componentes. As reações enzimáticas descritas aqui foram realizados a 37 ° C com o término hidroxilamina realizada a 60 ° C por 5 minutos. Esta temperatura mais elevada é fundamental para permitir a rápida conversão do fosfato restantes acetil para hidro…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio # 0920274 e Carolina do Sul Experiment Station Project (SC-1700340) para KSS. Este artigo é Não. Contribuição Técnica 5929 da Estação Experimental de Clemson University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |