Direkt detektion av acetat-bildande aktivitet av enzymet acetat Kinase
Summary
En metod för bestämning av acetat kinasaktivitet beskrivs. Denna analys använder en direkt reaktion för att bestämma enzymaktiviteten och kinetik för acetat kinas i acetat-bildande riktning med olika fosforylklorid som accepterar. Dessutom kan denna metod användas för testmetoder för andra acetyl fosfat eller Acetyl-CoA använder enzymer.
Abstract
Acetat kinas, en medlem av acetat och socker kinas-HSP70-aktin (ASKHA) enzym superfamiljen 1-5, ansvarar för den reversibla fosforyleringen av acetat till acetyl fosfat använda ATP som substrat. Acetat kinaser finns överallt i bakterier, som finns i ett släkte av arkéerna, och är också närvarande i mikrober i Eukarya 6. Den mest kännetecknas acetat kinas är att från metanbildande archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. En acetat kinas som bara kan använda PP-I men inte ATP i acetyl fosfat-bildande riktning har isolerats från Entamoeba histolytica, vilka smittämnen av amöba dysenteri, och har hittills bara hittats i denna genus 15,16.
I riktning mot acetyl fosfat bildas, är acetat kinasaktivitet normalt mätt med hydroxamate analys, som först beskrevs av Lipmann17-20, ett kombinerat test där omvandlingen av ATP till ADP är kopplad till oxidation av NADH till NAD + genom att enzymerna pyruvat kinas och laktatdehydrogenas 21,22 eller ett test som mäter utsläpp av oorganiskt fosfat efter reaktion acetyl fosfat produkt med hydroxylamin 23. Aktiviteten i den motsatta, är acetat-forming riktning mäts med koppling ATP bildas från ADP till en minskning av NADP + till NADPH av enzymer hexokinas och glukos-6-fosfatdehydrogenas 24.
Här beskriver vi en metod för detektion av acetat kinasaktivitet i riktning mot acetat formation som inte kräver koppling enzymer, utan istället bygger på direkt bestämning av acetyl fosfat konsumtion. Efter den enzymatiska reaktionen är kvar acetyl fosfat omvandlas till en järnklorid hydroxamate komplex som kan mätas spektrofotometriskt, som för hydroxamate analysen. Till skillnad från S: tandard tillsammans assay för denna riktning som är beroende av produktionen av ATP från ADP, kan denna direkta analys användas för acetat kinaser som producerar ATP eller PP i.
Protocol
Discussion
Upptäckten av acetyl fosfat i denna analys är beroende av en tillräcklig koncentration av hydroxylamin hydroklorid och koncentration och syra av järnklorid lösningen. Ändring av analysen volymen kommer att kräva omprövning av båda dessa komponenter. Den enzymatiska reaktioner som beskrivs här utfördes vid 37 ° C med hydroxylamin uppsägning utföras vid 60 ° C i 5 minuter. Denna högre temperatur är avgörande för att möjliggöra snabb omställning av de återstående acetyl fosfat till acetyl hydroxamat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSF utmärkelse # 0920274 och South Carolina Experiment Station Project (SC-1.700.340) till KSS. Detta papper är tekniskt bidrag nr 5929 i Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
