Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l'aide d'adénovirus dérivés Systems

Summary

Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l'infection des cellules, ce qui améliore l'efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Ce protocole basé sur l'utilisation d'un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l'unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

Abstract

Parvovirus des rongeurs (PV) comme chez le rat H-1PV et MVM, sont de petits icosaédrique, simple brin virus à ADN,. Leur génome comprend deux promoteurs P4 et P38 qui régulent l'expression des protéines non structurales (NS1 et NS2) et (capside VP1 et VP2), respectivement ^1. Ils attirent un grand intérêt en tant qu'agents anticancéreux pour leurs capacités oncolytiques et oncosuppressive tout en étant non-pathogènes pour l'homme ^2. NS1 est l'effecteur majeure du ³ cytotoxicité virale. Afin de renforcer davantage leurs activités naturelles antinéoplasiques, dérivés de ces vecteurs ont été générées par le remplacement du gène codant pour les protéines de la capside d'un transgène thérapeutique (par exemple un polypeptide cytotoxique, cytokine, une chimiokine tumeur du gène, suppresseur etc) ^4. Les parvovirus recombinants (recPVs) vecteur conserve les séquences NS1 / 2 de codage et les télomères du génome qui sont nécessaires PV pour l'amplification d'ADN viral et l'emballage. La production derecPVs se produit uniquement dans les cellules productrices (générale HEK293T), par co-transfection des cellules avec un second vecteur (pCMV-VP) exprimant le gène codant pour les protéines VP (fig. 1) ^4. Les vecteurs recPV générés de cette manière sont défectif pour la réplication. Bien que recPVs prouvé posséder une intensification des activités oncotoxic à l'égard des virus parentaux à partir de laquelle ils ont été générés, leur production reste un défi majeur et entrave fortement l'utilisation de ces agents dans la lutte contre le cancer des applications cliniques.

On a constaté que l'introduction d'un vecteur d'annonce-5 dérivée contenant l'E2a, E4 (orf6) et les gènes d'ARN VA (par exemple plasmide pXX6) dans HEK293T amélioré la production de recPVs de plus de 10 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Partant de ce constat, nous avons construit un roman Ad-VP-helper qui contient les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production recPVs ainsi que la parvovirnous VP gène unité ^5. L'utilisation d'Ad-VP-helper, permet la production de recom-PV en utilisant un protocole qui repose entièrement sur ​​les mesures infection virale (par opposition à la transfection de plasmide), ce qui rend possible l'utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (par exemple NB324K) ( Fig. 2). Nous présentons une méthode qui améliore considérablement la quantité de virus recombinant produit, réduisant à la fois le temps de production et les coûts, sans affecter la qualité du produit final ^5. En outre, la production à grande échelle de recPV (dans les cellules en suspension et les bioréacteurs) est maintenant envisageable.

Protocol

Notez que d'un laboratoire avec un niveau de biosécurité 2 est nécessaire pour la production de parvovirus recombinants (recPV).

Le protocole est subdivisé en deux parties principales. La première partie (production de recPV par transfection) est nécessaire pour produire la quantité minimale de recPVs qui sert d'inoculum dans la deuxième partie du protocole (production de recPVs via l'infection). Une fois une petite quantité de recPVs est produite, la première partie du protocole peut être omis, et le parvovirus recombinant peut être amplifié que par l'intermédiaire d'infection fournissant le gène codant pour les protéines de capside du parvovirus par l'assistant adénovirus (voir ci-dessous).

1. Production de recPVs via Transfection

1,1 transfection d'ADN viral

Il est possible d'utiliser n'importe quelle méthode d'ADN établi transfection dans cette section du protocole, soit à base de lipides cationiques ou phosphate de calcium. Nous utilisons généralement Fugene HRéactif de transfection D. Pour contrôler l'efficacité de transfection, nous vous recommandons de transfection plaque supplémentaire avec un plasmide exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (par exemple pEGFP-N1, Clontech). Transfection est considéré efficace et optimal pour la production de virus lorsqu'au moins 50% de la population cellulaire résulte EGFP-positives 24 heures après transfection.

1. 1 jour avant transfection, les cellules de semences, HEK293T 2 millions dans une plaque de 10 cm, pour obtenir 50% de confluence cellulaire à jour de la transfection. Cultiver les cellules dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec plus de 10% sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U par ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
2. Préparer le virus de décision mélange (1:2:1 rapport molaire) dans un tube de 1,5 ml:
   1. 3 pg de vecteur recPV hébergeant le transgène d'intérêt (ei pHH-1-GFP ^6).
   2. 6 pg de vecteur pCMV / VP ⁵ abriter l'unité du gène de capside du parvovirus
   3. 8 o ugf adénovirus dérivé plasmide auxiliaire pXX6 ^7.
3. Diluer le mélange des plasmides avec un milieu sans sérum jusqu'à 850 (concentration finale de 20 ng / pl) ul.
4. Ajouter 42,5 pi Fugene HD (2.5:1 Fugene ul rapport: pg d'ADN). Ne pas toucher le côté du tube lors de l'ajout au milieu Fugène.
5. Vortex doucement pendant 5-10 secondes.
6. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.
7. Ajouter les mélanges de transfection goutte à goutte aux cellules. Agiter la plaque doucement afin de répartir le mélange à travers.

1.2 Production Virus

1. Incuber la plaque à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO ₂ pendant 72 heures avant la récolte. Pendant cette période, des particules de parvovirus descendance sont formés à partir des plasmides parvovirus.

1,3 récolte de virus

1. Dans une hotte de culture tissulaire, racler les cellules au sein de leur milieu, aspirer et transférer la suspension de la plaque dans un 15en plastique ml tube.
2. Centrifuger le tube à 250 xg pendant 5 min à température ambiante.
3. Retirer 95% du surnageant.
4. Vortex doucement le tube pour remettre en suspension le culot dans le surnageant restant (environ 0,5 ml).
5. Congeler le tube à -80 ° C. Il est possible d'arrêter la production à ce stade ou de continuer avec le protocole.
6. Décongeler la suspension et l'amener à la température ambiante.
7. Congeler la suspension dans un bain d'azote liquide et de dégel dans l'eau chaude à 37 ° C. Vortex les tubes vigoureusement pendant 15 sec et répéter les cycles de gel-dégel en outre deux fois.
8. Centrifuger les tubes à 16.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
9. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le tube à ce stade contient la préparation de virus brut extrait.
10. Procéder à l'titrage du virus (voir ci-dessous). Pour la recPV portant le gène de la GFP, une production typique devrait donner 1-3 x 10 ⁷ unités infectieuses virales correspondant à environ 1 -3 x ¹⁰ 10 génome viral contenant des particules.

1.4 Stockage Virus

1. Pour stockage à long terme geler le tube contenant l'extrait virus brut à -80 ° C. Il est possible d'utiliser des extraits bruts virales comme inoculum dans la deuxième partie du protocole.

2. Production de recPVs par infection

Avant de commencer la production recPV par infection, de produire et de purifier l'adénovirus 5 portant le parvovirus VP gène (Ad-VP aide, décrit en ⁵⁾ selon le protocole standard ^8. Il est également nécessaire de disposer d'une quantité minimale de recPVs portant le transgène d'intérêt (par exemple, produit par transfection comme décrit ci-dessus).

Ci-dessous, nous décrivons la production recPV dans 175 cm ² flacon (T175) en format. Une amplification supplémentaire du stock viral produit de cette manière peut être menée dans 10 chambres de culture multicouches CellSTACK (Corning)avec des ajustements mineurs du protocole proposé.

2.1 Infection

1. 1 jour avant que les cellules d'infection de la plaque, les NB324K 10 millions dans un flacon T175 pour obtenir 60-80% de confluence cellulaire à la journée de l'infection. Préparer un second flacon contenant le même nombre de cellules sous forme de commande (cellules non infectées). Chaque T175 devrait avoir 20 ml de milieu essentiel minimum (MEM) en tant que volume final, supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100U par ml Penicillium et 100 pg / ml de streptomycine.
2. Le lendemain matin, préparer le mélange du virus dans un tube en plastique de 2 ml consistant en:
   1. Ad-VP-helper ⁵ à la multiplicité d'infection (MOI, unités infectieuses par cellule) = 10 (correspondant à 1 x 10 ⁸ unités infectieuses);
   2. recPVs à MOI = 0,5 (correspondant à 5 x 10 ⁶ unités infectieuses). Remplissez à 1,5 ml avec du MEM.
3. Appliquer le mélange dans un virus entier de la fiole T175.
4. Incuber laballon pendant 2 heures à 37 ° C, humidité 92%, 5% CO ₂ en secouant doucement toutes les 15 min.
5. Incuber pendant encore 20 à 24 h à 37 ° C, humidité 92%, 5% de CO _2.
6. Remplacez le milieu culturel du milieu frais.

2.2 La production de virus

Incuber les flacons à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO ₂ pendant 48 heures. Comme indication de la production virale efficace, des signes clairs de cytotoxicité doit être observée dans le flacon contenant virales des cellules infectées, en commençant 36-48 heures post-infection.

2,3 récolte de virus

1. Dans une hotte de culture tissulaire, aspirer et transférer le surnageant du milieu de la fiole dans un tube de 50 ml centrifugeuse.
2. Laver les cellules deux fois avec 1,5 ml de PBS.
3. Trypsiniser les cellules avec 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Ajouter la suspension de cellules dans le milieu enlevé.
4. Centrifuger les cellules et le surnageant à 5000 xg pendant 5 min à tempérament chambrerature.
5. Jeter le surnageant.
6. Ajouter 1 ml de tampon TE (1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) à la cellule et le culot vortexer doucement le tube pour remettre en suspension les cellules.
7. Congeler la suspension cellulaire dans un bain d'azote liquide et de dégel dans l'eau chaude à 37 ° C. Vortex vigoureusement le tube pendant 15 secondes et répéter le cycle de gel-dégel à trois reprises.
8. Traiter la suspension cellulaire avec 50 nucléase U / ml Benzonase pendant 30 min à 37 ° C afin de digérer l'ADN génomique de cellules et non-emballés ADN viraux.
9. Centrifuger le tube à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
10. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le surnageant à ce stade de la préparation contient le virus extrait brut. Les rendements typiques de recPV-GFP produite à la suite de ce protocole devrait être de l'ordre de 1-10 x 10 ⁸ unités infectieuses virales.

2.4 Entreposage Virus

1. Pour le stockage à court terme (maximum 2 mois), le virus conserver à 4 ° C.
2. Pour lonstockage à long terme g (plus de 2 mois), le virus conserver à -80 ° C.

3. Purification RecPV

1. Pour la purification de recPVs des lysats bruts, nous recommandons d'exécuter un gradient discontinu iodixanol selon Zolotoukhine et al. ^9. Nous vous recommandons d'utiliser un minimum de 5 ml d'extrait brut virale (obtenu à partir de la production dans cinq flacons T175) pour la purification de virus efficace.

4. Titrage Parvovirus recombinant

1. Effectuer le titrage recPV tel que décrit dans El-Andaloussi et al. ⁵

5. Contrôles de qualité

1. Utilisez le protocole décrit dans El-Andaloussi et al. ⁵ à vérifier la présence de virus de réplication indésirables compétentes (AN) effectuant un essai sur plaque parvovirus dans les cellules indicatrices NB324K.

6. Les résultats représentatifs

Un exemple de recPVs production par l'intermédiaire d'une transfection, en présence ou en l'absence d'éléments génomiques adénovirales est représenté sur la figure 3. Cellules ont été transfectées avec pCMV / VP (plasmide portant le gène codant pour les protéines de capside VP parvovirus) avec pHH-1-GFP (recPV une hébergeant le gène de la GFP) ou pHH-1-luciférase (recPV une hébergeant le gène de la luciférase de luciole) , avec (+ pXX6) ou sans (-pXX6) le pXX6 plasmide (portant l'adénovirus E2A, E4 (orf6) et VA gènes de l'ARN). Volume égal d'extraits cellulaires bruts ont été appliqués à NB324K cellules et transduction GFP ou luciférase essais ont été effectués comme indiqué dans El-Andaloussi et al. ^5. Une nette augmentation de la production recPVs a été obtenue en présence de pXX6 avec augmentation de la production de 0,3 unités GFP transductional (TU) ou de cellules obtenues selon des protocoles classiques à environ 5 TU / cellulaire obtenue à la suite de notre méthode (Fig. 3A, B). Une augmentation significative (environ 24 fois) de recPV productisur a également été observé dans le cas de PHH-1-luciférase (Fig. 3C). Ces résultats indiquent que le matériel génétique contenu dans pXX6 est capable de stimuler la production parvovirus.

Un exemple représentatif de la production par l'intermédiaire recPVs infection sont présentées dans la figure 4. Cellules ont été NB324K co-infectés par recPVs divers (comme indiqué dans la figure) et Ad-VP-helper (hébergeant le gène codant pour les protéines de capside VP PV). Ad-VP aide de production renforcée recPV jusqu'à> 70 TU par ensemencée cellule (figure 4A) sans augmenter la survenance d'indésirables capables de réplication des particules virales (Fig. 4B).

Figure 1. Vecteurs sur la base de parvovirus autonomes. (A) Haut: Le transgène remplace une partie des gènes VP-codage et est sous le contrôle du promoteur viral P38. Les gènes de NS1 / 2 sont à nouveauentretenus et leur expression est contrôlée par le promoteur viral P4. Le génome du vecteur est flanqué par le parvovirus RTI, qui contiennent des éléments agissant en cis qui sont nécessaires à la réplication et l'emballage du génome recombinant. Bas de: Un plasmide portant le gène de sous-VP soit une hétérologue (par exemple CMV.), Ou autologue (par exemple P38.) Promoteur (Px), est fourni en trans lors de la production recombinante de parvovirus, afin de compenser la perturbation des gènes de structure dans le génome recombinant. ITR, répétition terminale inversée. Figure adaptée de ^4. Schéma (B) du protocole classique utilisé pour la production de recPVs. HEK293T cellules sont transfectées transitoirement avec l'ADN viral (vecteur et plasmides auxiliaires) et au bout de trois jours, les cellules sont collectées et les virus récoltés.

Figure 2. La production d'recPVs avec lel'aide de l'Ad-VP. (A) des cartes schématiques des génomes recPV et Ad-VP. Le recPV contient un transgène hétérologue qui remplace une partie de la région VP. Le comité ad-VP abrite le gène parvovirus VP. Vue schématique (B) du protocole décrit dans ce manuscrit. Cellules NB324K sont co-infectés par recPV et Ad-VP virus. Après trois jours cellules sont récoltées et les particules recPV récupéré à partir du lysat cellulaire.

Figure 3. Stimulation de la production par recPV à base d'adénovirus plasmides pXX6. Cellules HEK293T, ensemencées dans des boîtes de 10 cm, ont été transfectées avec pCMV / VP en combinaison avec PHH-1-GFP (A et B) ou pHH-1-luciférase (C) pour produire recPVs. Simultanément, les cellules ont été co-transfectées avec les plasmides auxiliaires adénovirus dérivés pXX6 ou non, comme indiqué. Trois jours après la transfection, les cellules ont été récoltées et lysées par des cycles de gel et de dégel trois. Des volumes égaux de crudextraits de virus e ont été appliqués à NBK cellules indicatrices, et des essais de transduction ont été effectuées. (A) micrographies représentatives montrant cellules GFP-positives dans les monocouches confluentes NB324K. (B) Quantification des essais de transduction de GFP exprimée en unité de transduction (TU) par cellule ensemencée (C). La quantification de l'activité de la luciférase exprimée en unités relatives de la luciférase (RLU). Le dosage de la luciférase a été réalisée comme décrit dans El-Andaloussi et al. ^5. Colonnes représentent des valeurs moyennes de trois répétitions avec des barres d'écart-type. Nombre au sommet de la colonne + pXX6, dans (B et C), indique la multiplication dans les titres de virus recPV, obtenu en présence d'pXX6 versus sans.

Figure 4. Stimulation de la production recPV au moyen d'un virus recombinant Ad-helper VP. (A) des cellules NB324K, étaient les infectionsTed avec le virus purifié aide Ad-VP à une MOI de 10 (Ad-X unité / cellule, titré avec Adeno-X Kit Rapid titre), puis surinfectées avec l'un des parvovirus recombinants suivants Chi-hH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / cellule) ou H-1-GFP (0,5 TU / cellule) ^5. Un jour post-infection, le milieu a été changé et deux jours plus tard, les cellules ont été collectées et lysées par trois gel-dégel. Des extraits cellulaires bruts ont été utilisés pour déterminer le titre de virus par un test de transduction selon El-Andaloussi et al. ^5. TU, unité de transduction. (B) lots virales produites dans la présence ou l'absence d'Ad-VP ont été analysés pour leur teneur en particules virales compétentes pour la réplication (RCV) par dosage de plaque sur des cellules indicatrices NB324K.

Discussion

Nous avons montré que la production recPV peut être renforcée par la présence d'éléments génomiques adénoviraux. Nous avons augmenté les rendements recPV de plus de 10 fois (0,3 à 5 TU / cellule) en fournissant des éléments génomique adénovirus par transfection et de plus de 100 fois co-infectant les cellules avec Ad-VP-helper en combinaison avec le recPV dans Comparaison de protocoles conventionnels. Le protocole décrit ici peut être encore optimisée en déterminant le moment le plus approprié pour la livraison des éléments génomiques adénovirus et la concentration optimale d'Ad-VP aide à être utilisé pour l'infection.

RecPVs avec de grandes transgènes (plus de 1600 bases) sont moins efficacement produite. Cela est probablement dû au fait que par l'insertion du transgène, éléments agissant en cis nécessaires à l'ADN PV emballage adéquat virale sont supprimés. La taille optimale de transgène qui peut être inséré dans le génome PV sans affecter sa production est supérieure à 700 de bases ^6. Aussi le genre du transgène inséré peut affecter la production recPV (p. ex. Insertion de gènes codant pour des protéines cytotoxiques peuvent entraîner des rendements inférieurs recPV).

Un autre aspect important à prendre en considération lors de la production recPVs est la survenue éventuelle de virus capables de réplication (RCV) qui pourrait spontanément être formés par recombinaison homologue entre le parvovirus recombinant et VP-plasmides contenant. Le présent protocole ne renforce pas le risque de recombinaison. Néanmoins, un contrôle de la qualité AN devraient être régulièrement effectuées (p. ex. Dosage de plaque dans les cellules indicatrices NB324K ⁵⁾ à la fin de la production afin d'assurer que les stocks viraux ne contiennent qu'une quantité négligeable de RCVS.

Le protocole décrit surmonte les limitations antérieures dans le choix de la lignée cellulaire d'emballage utilisé, car elle rend possible l'utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (etne conviennent donc pas avec les protocoles basés sur la transfection), mais sont de bons producteurs de PV. par exemple. Cellules NB324K ¹⁰ que, dans nos mains étaient plus efficaces dans la production de recPVs que HEK293T (données non présentées). Une projection de différentes lignées cellulaires est maintenant possible d'appliquer le nouveau protocole, et pourrait identifier les cellules plus efficaces pour la production recPV. Cela ouvre également la voie à une exploration plus poussée du système de production à grande échelle des ex parvovirus recombinant. dans des bioréacteurs avec des cellules en suspension.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250