Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Summary

Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Abstract

Parvovírus roedores (PV), como ratos H-1PV e MVM, são pequenas Icosaédricos, solteiros encalhados vírus, o DNA. Seu genoma inclui dois promotores P4 e P38 que regulam a expressão de proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e da cápside (VP1 e VP2), respectivamente ^1. Eles atraem grande interesse como agentes anticâncer para suas habilidades e oncolíticos oncosuppressive enquanto ser não-patogênica para humanos ^2. NS1 é o efectora principal de ³ a citotoxicidade virai. A fim de melhorar ainda mais as suas actividades naturais antineoplásicos, derivados a partir destes vectores foram gerados através da substituição do gene que codifica para as proteínas da cápside com um transgene terapêutico (por exemplo, um polipéptido citotóxica, citocina, quimiocina gene do tumor, supressor etc) ^4. Os parvovírus recombinantes (recPVs) vector retém as sequências de NS1 / 2 de codificação e os telómeros genoma PV que sejam necessários para amplificação de DNA viral e embalagem. Produção derecPVs ocorre apenas nas células produtoras (geralmente HEK293T), por co-transfecção das células com um vector segundo (pCMV-VP) que expressa o gene que codifica para as proteínas VP (Fig. 1) ^4. Os vectores recPV geradas desta maneira são replicação defeituosa. Embora recPVs provou possuir actividades melhoradas oncotoxic com respeito aos vírus parental a partir da qual eles foram gerados, a sua produção continua a ser um importante desafio e fortemente dificulta a utilização destes agentes anti-cancerígenos, em aplicações clínicas.

Encontrámos que a introdução de um vector Ad-5 derivada contendo o E2a, E4 (ORF6) e os genes ARN VA (por exemplo, pXX6 plasmídeo) em HEK293T melhorou a produção de recPVs por mais de 10 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Com base nesta constatação, nós construímos um novo Ad-VP-helper que contém os elementos genómicos adenovirais necessárias para aumentar a produção recPVs, bem como a parvovirnos VP unidade gene ^5. A utilização de Ad-VP-helper, permite a produção de rec-PVs usando um protocolo que depende inteiramente de passos infecção viral (em oposição a transfecção de plasmídeo), tornando possível a utilização de linhas celulares que são difíceis de transfectar (por exemplo, NB324K) ( Fig. 2). Apresentamos um método que melhora grandemente a quantidade de vírus recombinante produzida, reduzindo tanto o tempo de produção e custos, sem afectar a qualidade do produto final ^5. Além disso, a produção em larga escala de recPV (em células em suspensão e biorreatores) é agora concebível.

Protocol

Note-se que um laboratório com um nível de segurança biológica 2 é necessário para a produção de parvovírus recombinantes (recPV).

O protocolo está subdividido em duas partes principais. A primeira parte (produção de recPV através de transfecção) é necessária para produzir a quantidade mínima de recPVs que serve como inoculo na segunda parte do protocolo (produção de recPVs via infecção). Uma vez que uma pequena quantidade de recPVs é produzido, a primeira parte do protocolo pode ser omitido, e do parvovírus recombinante pode ser amplificado apenas através de infecção proporcionando o gene que codifica para as proteínas da cápside parvovírus através do auxiliar de adenovírus (ver abaixo).

1. Produção de recPVs via transfecção

1,1 transfecção de ADN viral

É possível utilizar qualquer método de transfecção de ADN estabelecido nesta secção do protocolo ou baseados em lípidos catiónicos ou fosfato de cálcio. Nós usamos geralmente Fugene HD Reagente de transfecção. Para controlar a eficiência de transfecção, é recomendável para transfecção de chapa adicional com um plasmídeo expressando proteína verde fluorescente melhorado (por exemplo, pEGFP-N1, Clontech). A transfecção é considerada eficiente e ideal para a produção de vírus, quando pelo menos 50% da população de células resulta EGFP-positivas 24 horas após a transfecção.

1. 1 dia antes da transfecção, semente de 2 milhões de células HEK293T numa placa de 10 cm, para se obter 50% de confluência celular, no dia da transfecção. Crescer as células em 10 ml de Dulbecco modificado por Eagle Médium (DMEM) com adição de 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U por ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
2. Preparar vírus de tomada de mistura (01:02:01 razão molar) num tubo de 1,5 ml:
   1. 3 ug de recPV vector portador do transgene de interesse (EI PhH-1-GFP ^6).
   2. 6 mg de vetor pCMV / VP ⁵ abrigar o parvovírus unidade gene do capsídeo
   3. 8 mg of ajudante de adenovirus derivado do plasmídeo pXX6 ^7.
3. Dilui-se a mistura plasmídeos com meio isento de soro até 850 (concentração final de 20 ng / ul) uL.
4. Adicionar 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 Fugene ul ratio: DNA mg). Não toque lateral do tubo ao adicionar Fugene ao meio.
5. Vortex delicadamente por 5-10 segundos.
6. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Adicionar as misturas de transfecção, gota a gota às células. Agitar a placa suavemente para distribuir a mistura por toda parte.

1,2 produção de vírus

1. Incubar a placa a 37 ° C com uma humidade de 92% e _5% de CO2 durante 72 horas antes da colheita. Durante este período de partículas parvovírus progenitura são formados a partir dos plasmídeos parvovírus.

1,3 colheita Virus

1. Em um capuz de cultura de tecidos, raspar as células dentro de seu meio, aspirar e transferir a suspensão a partir da placa em um 15ml de plástico do tubo.
2. Centrifugar o tubo a 250 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Remover 95% do sobrenadante.
4. Vortex suavemente o tubo para ressuspender o sedimento para o sobrenadante remanescente (cerca de 0,5 ml).
5. Congelar o tubo à temperatura de -80 ° C. É possível parar a produção nesta fase ou para continuar com o protocolo.
6. Descongelar a suspensão e trazê-lo à temperatura ambiente.
7. Congelar a suspensão num banho de azoto líquido e descongelação em água morna a 37 ° C. Vortex os tubos vigorosamente durante 15 seg e repetir os ciclos de congelação-descongelação mais duas vezes.
8. Centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
9. Recolher o sobrenadante para um tubo fresco. O tubo nesta fase contém a preparação extracto bruto de vírus.
10. Prosseguir com a titulação do vírus (ver abaixo). Para a recPV que transporta o gene GFP, uma produção típica deve dar 1-3 x 10 ⁷ unidades infecciosas virais correspondentes a cerca de 1 -3 x ¹⁰ 10 genoma viral contendo partículas.

1,4 armazenamento Virus

1. Para armazenamento a longo prazo congelar o tubo contendo o extracto de vírus em bruto a -80 ° C. É possível utilizar bruto extractos virais como inoculo na segunda parte do protocolo.

2. Produção de recPVs via infecção

Antes de começar com a produção recPV via infecção, produzir e purificar adenovírus 5 carregando o parvovírus VP gene (Ad-VP ajudante, descrito em ⁵⁾ de acordo com o protocolo padrão ^8. É também necessário dispor de uma quantidade mínima de recPVs que transportam o transgene de interesse (eg, produzido através de transfecção, como descrito acima).

Abaixo, descrevemos a produção em 175 recPV frasco cm ² (T175) formato. Amplificação adicional da reserva de vírus produzido desta forma pode ser conduzida em 10 câmaras CellSTACK multicamadas de cultura (Corning)com pequenos ajustes do protocolo proposto.

2,1 Infecção

1. 1 dia antes da infecção, placa de 10 milhões de células NB324K em um balão T175 para se obter 60-80% de confluência celular, no dia da infecção. Preparar um segundo frasco que contém o mesmo número de células como um controlo (não-infectadas células). Cada T175 deve ter 20 ml de Meio Essencial Mínimo (MEM), como um volume final, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100U por ml penicilina e estreptomicina 100 ug / ml.
2. Na manhã seguinte preparar mistura vírus em um tubo de plástico de 2 ml que consiste em:
   1. Ad-VP-helper ⁵ a multiplicidade de infecção (MOI, unidades infecciosas / célula) = 10 (correspondendo a 1 x 10 ⁸ unidades infecciosas);
   2. recPVs a uma moi = 0,5 (correspondente a 5 x 10 ⁶ unidades infecciosas). Completar a 1,5 ml com MEM.
3. Aplicar a mistura em um vírus inteiro do balão T175.
4. Incubar abalão durante 2 horas a 37 ° C, humidade 92%, 5% de CO ₂ agitando suavemente a cada 15 min.
5. Incubar durante mais 20-24 horas a 37 ° C, humidade 92%, 5% de CO _2.
6. Substitua o meio cultural por meio fresco.

2,2 produção de vírus

Incubar os frascos a 37 ° C com uma humidade de 92% e 5% de CO ₂ durante 48 horas. Como indicação da produção virai eficiente, sinais claros de citotoxicidade deve ser observado no balão contendo virais células infectadas, começando 36-48 horas após a infecção.

2,3 colheita Virus

1. Em um capuz de cultura de tecidos, aspirar e transferir o sobrenadante médio a partir do balão para um tubo de centrífuga de 50 ml.
2. Lave as células duas vezes com 1,5 ml de PBS.
3. Trypsinize as células com 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Adicionar a suspensão de célula para o meio removido.
4. Centrifugar as células eo sobrenadante a 5000 xg durante 5 min a têmpera quartotura.
5. Descartar o sobrenadante.
6. Adicionar 1 ml de tampão TE (1 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 8,7) para o pellet celular e suavemente vórtice do tubo para ressuspender as células.
7. Congelar a suspensão de células em um banho de azoto líquido e descongelação em água morna a 37 ° C. Vórtice do tubo vigorosamente durante 15 seg e repetir o ciclo de congelamento-descongelamento três vezes.
8. Tratar a suspensão de células com 50 U / ml Benzonase Nuclease durante 30 min a 37 ° C, a fim de digerir a genómico da célula e não embalados DNAs virais.
9. Centrifugar o tubo a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
10. Recolher o sobrenadante para um tubo fresco. O sobrenadante, nesta fase, contém a preparação extracto bruto de vírus. Rendimentos típicos de recPV-GFP produzidos seguindo este protocolo deve estar no intervalo de 1-10 x 10 ⁸ unidades infecciosas virais.

2,4 armazenamento Virus

1. Para armazenamento a curto prazo (máximo de 2 meses), vírus da loja a 4 ° C.
2. Para long armazenagem a longo prazo (mais de 2 meses), vírus da loja a -80 ° C.

3. Purificação RecPV

1. Para a purificação de recPVs a partir dos lisados ​​brutos, é recomendável para executar um gradiente descontínuo de acordo com a iodixanol Zolotukhin et ai. ^9. Sugerimos utilizando um mínimo de 5 ml de extracto de viral em bruto (obtido a partir de produção em cinco frascos T175) para a purificação do vírus eficiente.

4. Titulação Parvovirus recombinante

1. Realizar titulação recPV como descrito no et al El-Andaloussi. ⁵

5. Controles de Qualidade

1. Use o protocolo descrito no et al El-Andaloussi. ⁵ para verificar a presença de vírus de replicação indesejáveis ​​competentes (RCV) que realizam ensaios de placa de parvovírus em células indicadoras NB324K.

6. Os resultados representativos

Um exemplo de recPVs productioN através de transfecção na presença ou ausência de elementos genómicos de adenovirus é mostrado na Figura 3. As células foram transfectadas com pCMV / VP (plasmídeo portador do gene que codifica para as proteínas da cápside parvovírus VP), juntamente com PhH-1-GFP (um recPV abrigando o gene GFP) ou PhH-1-luciferase (um recPV abrigando o gene da luciferase do pirilampo) , com (+ pXX6) ou sem (-pXX6) a pXX6 plasmídeo (carregando o adenovírus E2A, E4 (ORF6) e os genes ARN VA). Volume igual de extractos celulares brutos foram aplicados a NB324K células e de transdução de GFP ou ensaios de luciferase foram realizados como relatado em et al El-Andaloussi. ^5. Um aumento claro na produção recPVs foi obtida na presença de pXX6 com o aumento da produção de 0,3 unidades de transdução de GFP (TU) / célula obtido de acordo com protocolos convencionais para cerca de 5 TU / célula obtido seguindo o nosso método (Fig. 3A, B). Um aumento significativo (cerca de 24 vezes) de recPV Production foi também observada no caso de PhH-1-luciferase (Fig. 3C). Estes resultados indicam que o material genético contido no pXX6 é capaz de aumentar a produção de parvovírus.

Um exemplo representativo de produção recPVs via infecção é mostrado na Figura 4. Células NB324K foram co-infectadas com vários recPVs (como indicado na figura) e Ad-VP-helper (abrigando o gene que codifica para as proteínas da cápside de PV VP). Ad-VP auxiliar ainda reforçada produção recPV até> 70 TU por seeded célula (Fig. 4A), sem aumentar a ocorrência de replicação competente indesejáveis ​​partículas virais (Fig. 4B).

Figura 1. Vectores com base em parvovírus autónomas. (A) superior: O transgene substitui parte dos genes que codificam VP-e está sob o controlo do promotor viral P38. Os genes para NS1 / 2 são resustentado e sua expressão é controlada pelo promotor viral P4. O genoma do vector é flanqueado por ITRs o parvovírus, que contêm cis-acting elementos que são necessários para a replicação e empacotamento do genoma recombinante. Conclusão: Um plasmídeo portador do gene VP-sob qualquer uma heterólogo (por exemplo, por CMV.), Ou autólogo promotor (por exemplo P38.) (PX), é fornecido em trans, durante a produção recombinante parvovírus, a fim de compensar as perturbações dos genes estruturais no genoma recombinante. ITR, repetição terminal invertida. Figura adaptada de ^4. (B) vista esquemática do protocolo clássico utilizado para a produção de recPVs. HEK293T células são transfectadas transitoriamente com o DNA viral (vector e plasmídeos auxiliares) e depois de três dias, as células são recolhidas e vírus colhido.

Figura 2. Produção de recPVs com oajuda da Ad-VP. (A) mapas esquemáticos de genomas recPV e Ad-VP. O recPV contém um transgene heterólogo que substitui parte da região VP. O Ad-VP abriga o parvovírus gene VP. (B) Representação esquemática do protocolo descrito no presente manuscrito. NB324K células são co-infectados com recPV e Ad-VP vírus. Depois de três dias as células são colhidas e partículas recPV recuperado a partir de lisados ​​de células.

Figura 3. A estimulação da produção recPV por adenovírus baseados plasmídeos pXX6. Células HEK293T, semeado em 10 pratos cm, foram transfectadas com pCMV / VP em combinação com PhH-1-GFP (A e B) ou PhH-1-luciferase (C) para produzir recPVs. Simultaneamente, as células foram co-transfectadas com os plasmídeos derivados de adenovirus auxiliar pXX6 ou não, como indicado. Três dias após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas por três ciclos de congelamento e descongelamento. Volumes iguais de crudextractos vírus de e foram aplicadas a NBK células indicadoras, e ensaios de transdução foram realizadas. (A) micrografias representativos mostrando células GFP positivas dentro monocamadas confluentes. NB324K (B) Quantificação dos ensaios de transdução de GFP expressa em unidade de transdução (TU) por célula seeded . (C) Quantificação da actividade de luciferase expressos como unidades relativas de luciferase (RLU). O ensaio de luciferase foi realizada como descrito em et al El-Andaloussi. ^5. Colunas representam os valores médios de três repetições com barras de desvio padrão. Número no topo da coluna + pXX6, em (B e C), indica o aumento vezes nos títulos de vírus recPV, obtida na presença de pXX6 versus sem.

Figura 4. Estimulação da produção de recPV por meio de recombinante vírus auxiliar Ad-VP. (A) células NB324K, foram infecçãoted com purificado vírus auxiliar Ad-VP a uma moi de 10 (Ad-X unidade / célula, titulado com adeno-X rápida Titer Kit) e, em seguida superinfected com um dos seguintes parvovírus recombinante Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / célula) ou H-1-GFP (0,5 TU / célula) ^5. Um dia pós-infecção, o meio foi mudado e dois dias mais tarde, as células foram recolhidas e lisadas através de três congelamento-descongelamento e ciclos. Extractos celulares brutos foram usados ​​para determinar os títulos de vírus por ensaio de transdução de acordo com et al El-Andaloussi. ^5. TU, a unidade de transdução. (B) lotes virais produzidas na presença ou ausência de Ad-VP foram analisadas para o seu conteúdo de replicação competente partículas virais (VN) por ensaio de placa sobre células indicadoras NB324K.

Discussion

Nós mostramos que a produção de recPV pode ser aumentada pela presença de elementos genómicos adenovirais. Temos aumentou os rendimentos recPV por mais de 10 vezes (0,3-5 TU / célula), fornecendo elemento genómico adenovírus através de transfecção e por mais de 100 vezes o co-infectando as células com Ad-VP-helper em combinação com o recPV em comparação com protocolos convencionais. O protocolo descrito aqui pode ser ainda mais optimizado através da determinação do tempo mais apropriado para a entrega dos elementos genómicos de adenovirus e da concentração óptima de Ad-VP auxiliar para ser utilizada para a infecção.

RecPVs com transgenes maiores (mais de 1.600 bases) são menos eficientemente produzido. Isto é provavelmente devido ao facto de que, ao inserir o transgene, cis-acting elementos necessários para PV embalagem de DNA adequada viral são removidos. O tamanho óptimo do transgene, que pode ser inserido no genoma PV sem afectar a sua produção é de até 700 base des ^6. Além disso, o tipo do transgene inserido pode afectar recPV produção (por exemplo. Inserção de genes que codificam para proteínas citotóxicas pode resultar em rendimentos mais baixos recPV).

Outro aspecto importante a ter em consideração durante a produção recPVs é a possível ocorrência de replicação de vírus competentes (VN), que poderia ser formada espontaneamente através de recombinação homóloga entre o parvovírus recombinante e VP contendo plasmídeos. O presente protocolo não aumenta o risco de recombinação. No entanto um controlo de qualidade VN deve ser realizada rotineiramente (por exemplo. Ensaio de placa em células indicadoras NB324K ⁵⁾ no final da produção, a fim de assegurar que as reservas virais contêm apenas uma quantidade insignificante de RCVs.

O protocolo descrito supera as limitações anteriores na escolha da linha celular de empacotamento utilizado, uma vez que torna possível a utilização de linhas celulares que são difíceis de transfectar (eportanto, não é adequado com protocolos baseados em transfecção), mas são bons produtores de PVs. por exemplo. Células NB324K ¹⁰ que nas nossas mãos foram mais eficientes na produção recPVs do que HEK293T (dados não mostrados). A seleção de linhagens celulares diferentes, é agora possível a aplicação do novo protocolo, e pode identificar as células mais eficientes para a produção recPV. Isso também abre caminho para uma maior exploração do sistema de produção em larga escala por exemplo de parvovírus recombinante. em biorreactores com células em suspensão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250