Эффективное производство рекомбинантных парвовирус с помощью аденовируса производные системы

Summary

Здесь мы опишем протокол, основанный только на клеточных инфекций, что повышает эффективность рекомбинантного парвовирус более чем в 100 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. Этот протокол основан на использовании новых аденовирус 5-помощник на основе содержащий транскрипцию парвовирус В.П. единицы (Ad-VP).

Abstract

Грызун парвовирусов (PV), таких как крысы H-1PV и MVM, малы икосаэдра, одноцепочечной, вирусов ДНК. Их геном состоит из двух промоутеров P4 и P38, которые регулируют экспрессию неструктурных (NS1 и NS2) и капсид белков (VP1 и VP2), соответственно ^1. Они привлекают большой интерес в качестве противоопухолевого средства для их онколитических и oncosuppressive способности в то же время, не патогенных для человека ^2. NS1 является основным эффекторных вирусных ³ цитотоксичности. В целях дальнейшего повышения их естественной противоопухолевой деятельности, производные от этих векторов были получены заменой ген, кодирующий белки капсида с терапевтическим трансгенов (например, цитотоксический полипептид, цитокинов, хемокинов, гена супрессора опухоли и т.д.) ^4. Рекомбинантный парвовирусов (recPVs) вектор сохраняет NS1 / 2 кодирующих последовательностей генома и PV теломеры, которые необходимы для вирусной амплификации ДНК и упаковки. ПроизводствоrecPVs происходит только в клетках производителей (как правило, HEK293T), по совместной трансфекции клеток со второй вектор (pCMV-VP), выражающая ген, кодирующий В.П. белков (рис. 1) ^4. RecPV векторов, таким образом, являются репликации неисправен. Хотя recPVs оказалось обладают расширенной oncotoxic деятельности по отношению к родительской вирусы, от которых они были получены, их производство остается серьезной проблемой и сильно затрудняет использование этих препаратов в борьбе с раком клинического применения.

Мы обнаружили, что введение Ad-5 производным вектор, содержащий Е2, Е4 (orf6) и VA РНК генов (например, pXX6 плазмиды) в HEK293T улучшить производство recPVs более чем в 10 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. На основании этого вывода, мы построили новый Ad-VP-помощник, который содержит геномную аденовирусной элементы, необходимые для повышения recPVs производства, а также parvovirнам вице-президент ген блок ^5. Использование Ad-VP-помощником, позволяет производить REC-клипов, используя протокол, который полностью полагается на вирусную инфекцию шаги (в отличие от трансфекции плазмиды), что делает возможным использование клеточных линий, которые являются трудными для трансфекции (например, NB324K) ( Рис. 2). Мы представляем метод, который значительно повышает количество рекомбинантного вируса производства, снижая время и затраты производства, не влияя на качество конечного продукта ^5. Кроме того, крупномасштабное производство recPV (в виде суспензии клеток и биореакторы) теперь возможно.

Protocol

Обратите внимание, что лаборатории с уровнем биобезопасности 2, необходимого для производства рекомбинантных парвовирусов (recPV).

Протокол, подразделяется на две основные части. В первой части (производство recPV помощью трансфекции) требуется для получения минимального количества recPVs, который служит посевной во второй части протокола (производство recPVs через инфекция). После небольшого количества recPVs производится, первая часть протокола может быть опущен, и рекомбинантный парвовирус может усиливаться только через заражение обеспечения ген, кодирующий белки капсида парвовирус через аденовирус помощник (см. ниже).

1. Производство recPVs через Трансфекция

1,1 Вирусные трансфекции ДНК

Можно использовать любой установленный метод ДНК трансфекции в этом разделе протокола либо на основе катионных липидов или фосфата кальция. Мы обычно используем Fugene HD Трансфекция реагентов. Для контроля эффективности трансфекции, мы рекомендуем трансфекции дополнительные пластины с плазмиды выражения расширения зеленого флуоресцентного белка (например, pEGFP-N1, Clontech). Трансфекция считается эффективным и оптимальным для производства вируса, когда по крайней мере 50% от популяции клеток результате EGFP-инфицированным через 24 часа после трансфекции.

1. 1 день до трансфекции, семена 2000000 HEK293T клеток в 10 см пластины, чтобы получить 50% сотовых слияния в день трансфекции. Рост клеток в 10 мл изменения Eagle Дульбекко среды (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 U на мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
2. Подготовить вирус решений смеси (1:02:01 молярное соотношение) в 1,5 мл трубки:
   1. 3 мкг recPV вектор укрывательство трансгенов интерес (е PHH-1-GFP ^6).
   2. 6 мкг вектора pCMV / VP ^5, несущих ген парвовирус капсида блок
   3. 8 мкг ое аденовирус-производных помощник плазмиды pXX6 ^7.
3. Разведите смесь плазмид с бессывороточной среде до 850 мкл (конечная концентрация 20 нг / мкл).
4. Добавить 42,5 мкл Fugene HD (соотношение 2,5:1 мкл Fugene: мкг ДНК). Не прикасайтесь к стороне трубки при добавлении Fugene в среду.
5. Vortex мягко в течение 5-10 секунд.
6. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 минут.
7. Добавить трансфекции смеси по каплям к клеткам. Встряхните пластины аккуратно, чтобы равномерно распределить смесь по всему.

1,2 вирус производства

1. Инкубируйте планшет при 37 ° С, влажность воздуха 92% и 5% CO ₂ в течение 72 часов до сбора урожая. За это время частицы потомство парвовирус формируются из парвовирус плазмид.

1,3 вирусов урожая

1. В капоте культуры тканей, очистить клетки в их среде, аспирации и передачи об отстранении от пластины в 15мл пластиковых труб.
2. Центрифуга трубке при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Удалить 95% супернатант.
4. Вихревые трубки осторожно ресуспендируют осадок в оставшейся надосадочной жидкости (около 0,5 мл).
5. Замораживание труб при температуре -80 ° C. Вполне возможно, остановить производство на данном этапе или продолжить с протоколом.
6. Размораживания подвески и привести его при комнатной температуре.
7. Замораживание суспензии в жидкой ванне азота и оттепель в теплой воде при температуре 37 ° C. Вихревые трубки энергично в течение 15 секунд и повторите замораживания-оттаивания цикл еще два раза.
8. Центрифуга труб при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° C.
9. Соберите супернатант в новую пробирку. Труба на этом этапе содержит экстракт сырой подготовке вируса.
10. Продолжайте титрование вирусов (см. ниже). Для recPV несущих ген GFP, типичный производство должно дать 1-3 х 10 ⁷ вирусных инфекционных единиц соответствует примерно 1 -3 х ¹⁰ 10 вирусного генома, содержащих частицы.

1,4 вирусов хранения

1. Для длительного хранения заморозить пробирку сырой экстракт вирус при температуре -80 ° C. Можно использовать сырой вирусных экстракты в качестве посевного во второй части протокола.

2. Производство recPVs через инфекцией

Перед началом производства recPV через заражение, производить и очищать аденовирус 5 проведении парвовирус В.П. генов (Ad-VP помощник, описанные в п. ⁵⁾ в соответствии со стандартом протокола ^8. Необходимо также иметь минимальное количество recPVs проведение трансгенной интерес (например, производится с помощью трансфекции, как описано выше).

Ниже мы опишем recPV производства в 175 см ² колбы (T175) формате. Дальнейшее усиление вируса акции, произведенные таким образом может быть проведена в 10 многослойных CellSTACK культуры камеры (Corning)с незначительными изменениями протокола предложил.

2,1 Инфекция

1. 1 день до заражения, плиты 10000000 NB324K клеток в колбе T175 получить 60-80% сотовых слияния в день инфекции. Подготовить вторую колбу, содержащую то же количество клеток в качестве контроля (не инфицированные клетки). Каждый T175 должно быть 20 мл минимально необходимого среднего (MEM), а конечный объем, с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100U на пенициллин мл и 100 мкг / мл стрептомицина.
2. На следующее утро готовить смесь вируса в 2 мл пластиковая трубка, состоящая из:
   1. Ad-VP-помощник ⁵ при множественности заражения (МВД, инфекционных единиц / клетку) = 10 (что соответствует 1 х 10 ⁸ инфекционных единиц);
   2. recPVs в МВД = 0,5 (соответствует 5 х 10 ⁶ инфекционных единиц). Завершить до 1,5 мл MEM.
3. Примените всю смесь вируса в одном из T175 колбу.
4. Инкубируйтеколбу в течение 2 часов при температуре 37 ° C, влажность 92%, 5% CO _2, осторожно встряхивая каждые 15 мин.
5. Инкубируйте для дальнейшего 20-24 часов при температуре 37 ° C, влажность 92%, 5% СО _2.
6. Замените культурную среду с свежую среду.

2,2 вирус производства

Инкубируйте колбы при 37 ° С и влажности 92% и 5% CO ₂ в течение 48 часов. Как указанием эффективного вирусного производства, явных признаков цитотоксичности должны быть соблюдены в колбу, содержащую вирусную инфицированных клетках, начиная с 36-48 часов после заражения.

2,3 вирусов урожая

1. В капоте культуры тканей, аспирации и передачи среднего супернатант из колбы в 50 мл центрифужную пробирку.
2. Промойте клетки в два раза с 1,5 мл PBS.
3. Trypsinize клеток с 1,5 мл 0,25% Trysin-ЭДТА. Добавить клеточной суспензии для удаленной среды.
4. Центрифуга клетки и супернатант при 5000 мкг в течение 5 мин при комнатной температурепературы.
5. Удалите супернатант.
6. Добавить 1 мл буфера TE (1 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,7) в осадок клеток и мягко вихревой трубки для ресуспендирования клеток.
7. Замораживание суспензии клеток в жидкой ванне азота и оттепель в теплой воде при температуре 37 ° C. Вихревые трубки энергично в течение 15 секунд и повторите замораживания-оттаивания циклом в три раза.
8. Относитесь к клеточной суспензии с 50 Ед / мл Benzonase нуклеазы в течение 30 мин при 37 ° С для того, чтобы переварить генома клетки и не упакованные вирусной ДНК.
9. Центрифуга трубки на 5000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C.
10. Соберите супернатант в новую пробирку. Супернатант на данном этапе содержит экстракт сырой подготовке вируса. Типичные выходы recPV-GFP производится после этого протокола должна быть в диапазоне 1-10 х 10 ⁸ вирусных инфекционных единиц.

2,4 вирусов хранения

1. За короткий срок хранения (не более 2 месяцев), магазин вирус при температуре 4 ° C.
2. Для LONг Срок хранения (более 2 месяцев), магазин вирус при температуре -80 ° C.

3. RecPV очистки

1. Для очистки recPVs из сырой лизатов, мы рекомендуем запускать иодиксанол градиент разрывной по Золотухин и соавт. ^9. Мы рекомендуем использовать не менее 5 мл сырой вирусных экстракта (полученный от производства в пять T175 колбы) для эффективной очистки вируса.

4. Рекомбинантный титрования парвовирус

1. Выполните recPV титрования, как описано в Эль-Andaloussi и др. ^5.

5. Качество управления

1. Используйте протокол, описанный в Эль-Andaloussi и др. ^5. Проверить на наличие нежелательных репликации компетентных вирусов (RCV) проведение анализа парвовирус бляшки в клетках NB324K индикатора.

6. Представитель Результаты

Пример recPVs блузочныея через трансфекции в присутствии или отсутствии элементов генома аденовируса показано на рисунке 3. Клетки трансфицированных pCMV / VP (плазмид, несущих ген кодировку для парвовирус В.П. белки капсида) вместе с ПГГ-1-GFP (recPV укрывательство ген GFP) или ПГГ-1-люциферазы (recPV укрывательство гена люциферазы светляков) , с (+ pXX6) или без (-pXX6) pXX6 плазмиды (проведение аденовирус Е2, Е4 (orf6) и В. А. РНК генов). Равные объемы сырой клеточных экстрактов были применены к NB324K клеток и трансдукции GFP или люциферазы анализы были проведены, как сообщили в Эль-Andaloussi соавт. ^5. Явное увеличение производства recPVs было получено в присутствии pXX6 с увеличением производства от 0,3 GFP transductional единиц (ТУ) / элемент полученные в соответствии с общепринятыми протоколами приблизительно 5 ТУ / элемент получен после нашего метода (рис. 3А, Б). Значительное увеличение (около 24 раз) в recPV productiна наблюдалась также в случае PHH-1-люциферазы (рис. 3в). Эти результаты показывают, что генетический материал, содержащийся в pXX6 может повысить парвовирус производства.

Типичный пример recPVs производства через инфекции показано на рисунке 4. NB324K клетки были заражены различными recPVs (как указано на рисунке) и Ad-VP-хелперов (укрывательство ген, кодирующий П. П. белков капсида). Ad-помощник вице-президент дальнейшего расширения recPV производства до> 70 ТУ на отобранные клетки (рис. 4), не увеличивая появление нежелательных репликацию вирусных частиц компетентным (рис. 4В).

Рисунок 1. Векторы на основе автономных парвовирусов. (А) Начало: трансгенов заменяет часть VP-кодирующих генов и находится под контролем вирусного промотора P38. Генов NS1 / 2 повторноtained и их выражение контролируется вирусный промотор P4. Вектор генома в окружении парвовирусного РМЭ, которые содержат цис-действующих элементов, которые необходимы для репликации и упаковки рекомбинантного генома. Внизу: плазмиды проведение VP-гена под любой гетерологичной (например, ЦМВ.) Или аутологичной (например, P38). Промотора (Р), поставляется в транс во время рекомбинантных парвовирус для того, чтобы компенсировать нарушения структурных генов В рекомбинантного генома. ИТР, перевернутый концевой повтор. Рисунок адаптирован из ^4. (B) Схема классического протокола, используемого для производства recPVs. HEK293T клетки временно трансфекции с вирусной ДНК (вектор и помощник плазмиды) и через три дня, клетки собираются и вирусы собрано.

Рисунок 2. Производство recPVs спомочь в Ad-VP. (А) Схема карты recPV и Ad-VP геномов. RecPV содержит гетерологичных трансгенов которая заменяет часть региона VP. Ad-VP таит в себе ген парвовирус VP. (Б) Схематическое изображение протокол, описанный в этой рукописи. NB324K клетки с сочетанной инфекцией recPV и Ad-VP вирусов. После трех дней клетки собирают и recPV частиц оправился от клеточного лизата.

Рисунок 3. Стимуляция recPV производства аденовирус основе плазмид pXX6. HEK293T клетки посеяны в 10 см блюда были трансфицированных pCMV / VP в сочетании с ПГГ-1-GFP (А и В) или ПГГ-1-люциферазы (C), чтобы произвести recPVs. Одновременно клетки совместно трансфицированных аденовирус-производных помощник плазмиды pXX6 или нет, как указано. Через три дня после трансфекции клетки собирают и лизируют три замораживания и оттаивания. Равные объемы падлаЭкстракты электронного вируса были применены к НБК показатель клеток, трансдукции и анализы были проведены. (А) представитель микрофотографии показывает GFP-положительных клеток в сливной монослоев NB324K. (B) Количественная оценка анализов GFP трансдукции выражается в передаче единицы (ТУ) на ячейку семенами . (C) Количественное определение активности люциферазы выражается в относительных единицах люциферазы (РГ). Люциферазы анализ проводили, как описано в Эль-Andaloussi соавт. ^5. Столбцы представляют собой среднее значение из трех повторяет стандартные бары отклонения. Номер в верхней части колонки + pXX6 в (В и С), указывает на кратное увеличение титра recPV вируса, полученные в присутствии pXX6 против без.

Рисунок 4. Стимулирование производства recPV с помощью рекомбинантных Ad-помощник вице-президент вирус. (A) NB324K клеток, были инфекцииТед с очищенным Ad-помощник вице-президент вирус в МВД 10 (Ad-X устройство / клетки, титруют адено-X Быстрая Титр Kit), а затем superinfected с одним из следующих рекомбинантный парвовирус ^Чи-HH-1-11 EGFP (0.1 ТУ / клетку) или Н-1-GFP (0,5 ТУ / клетка) ^5. В один прекрасный день после заражения, среда изменилась, и через два дня, клетки были собраны и лизируются через три стоп-и-оттаивания. Сырой клеточных экстрактов были использованы для определения вируса титры с помощью трансдукции анализа в соответствии с Эль-Andaloussi соавт. ^5. Ту, трансдукция единицы. (B) Вирусные партиями производится в присутствии отсутствие Ad-П были проанализированы на предмет содержания в них репликацию вирусных частиц компетентным (RCV) от налета анализ на клетки NB324K индикатора.

Discussion

Мы показали, что recPV производства может быть повышена за счет наличия аденовирусной элементов генома. Мы увеличили recPV урожайности более чем в 10 раз (с 0,3 до 5 ТУ / клетку), предоставляя элемент генома аденовируса с помощью трансфекции и более чем в 100 раз совместное заражение клеток с Ad-VP-помощник в сочетании с recPV в по сравнению с обычными протоколами. Протокол, описанный здесь, может быть оптимизирована путем определения наиболее подходящего времени для доставки элементов генома аденовируса и оптимальной концентрации Ad-VP помощник, который будет использоваться для инфекции.

RecPVs с большим трансгенов (более 1600 баз) менее эффективно производится. Вероятно, это связано с тем, что путем введения трансгена, цис-действующих элементов, необходимых для надлежащего PV вирусных упаковки ДНК удаляются. Оптимальный размер трансгенов, которые можно вставить в геном PV без ущерба для его производства до 700 базовыхс ^6. Кроме того, вид трансгена вставляется может повлиять recPV производства (например,. Включение генов, кодирующих белки цитотоксических может привести к снижению урожайности recPV).

Еще один важный аспект принять во внимание в процессе производства recPVs является возможность возникновения репликации компетентных вирусов (RCV), которые могут спонтанно формироваться через гомологичной рекомбинации между рекомбинантный парвовирус и VP-содержащие плазмиды. Настоящий Протокол не способствует рекомбинации риска. Тем не менее, контроль качества RCV должна регулярно выполняться (например,. Анализ налета в клетках NB324K индикатор ⁵⁾ в конце производства, чтобы гарантировать, что вирусные акции содержат лишь незначительное количество RCVs.

В протоколе описаны преодолеть предыдущие ограничения в выборе линии упаковки используемой базовой станции, как это делает возможным использование клеточных линий, которые являются трудными для трансфекции (ипоэтому не подходит с протоколами на основе трансфекции), но хорошие производители клипов. например. NB324K клеток ^10, что в наших руках были более эффективны в производстве, чем recPVs HEK293T (данные не представлены). Скрининг различных клеточных линий теперь можно применении нового протокола, и может определить более эффективные клетки для производства recPV. Это также открывает путь к дальнейшему изучению системы для крупномасштабного производства рекомбинантных например, парвовирус. В биореакторах с клеток в суспензии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250