Effektiv Rekombinant Parvovirus Produktion ved hjælp af adenovirusafledte Systems

Summary

Her beskriver vi en protokol baseret udelukkende på celle-infektion, hvilket forbedrer effektiviteten af ​​rekombinant parvovirus produktion med mere end 100 gange i sammenligning med andre protokoller, der anvendes. Denne protokol er afhængig af anvendelsen af ​​en hidtil ukendt adenovirus 5-baserede helper indeholdende parvovirus VP transkriptionsenhed (Ad-VP).

Abstract

Gnavere parvovirus (PV) såsom rotte H-1PV og MVM, er små ikosaedriske, enlige strandede, DNA virus. Deres genom omfatter to promotorer P4 og P38, der regulerer ekspressionen af ikke-strukturelle (NS1 og NS2) og capsidproteiner (VP1 og VP2) henholdsvis ^en. De tiltrækker store interesse som anticancermidler for deres onkolytiske og oncosuppressive evner og samtidig være ikke-patogene for mennesker ^2. NS1 er den største effektor af viral cytotoksicitet ^3. For yderligere at forbedre deres naturlige antineoplastiske aktiviteter er derivater fra disse vektorer blevet frembragt ved at erstatte det gen der koder for capsidproteinerne med et terapeutisk transgen (f.eks cytotoksisk polypeptid, cytokin, chemokin, tumorsuppressorgen etc.) ^4. De rekombinante parvovira (recPVs) vektor bevarer NS1 / 2 kodende sekvenser og PV genom telomerer, der er nødvendige for viral DNA-amplifikation og emballering. Fremstilling afrecPVs kun forekommer i de producerende celler (sædvanligvis HEK293T) ved co-transfektion af celler med en anden vektor (pCMV-VP), der udtrykker genet, der koder for VP proteiner (fig. 1) ^4. De recPV vektorer genereret på denne måde, er replikationsdefekt. Selv recPVs vist sig at have bedre oncotoxic aktiviteter med hensyn til forældrenes virus, hvorfra de er blevet genereret, deres produktion fortsat en stor udfordring og stærkt hæmmer brugen af ​​disse stoffer i anti-cancer kliniske anvendelser.

Vi fandt, at introduktionen af en Ad-5 afledte vektor indeholdende E2a, E4 (ORF6) og VA RNA-gener (f.eks pXX6 plasmid) i HEK293T forbedret produktion af recPVs med mere end 10 gange i sammenligning med andre protokoller, der anvendes. Baseret på denne opdagelse har vi konstrueret en ny Ad-VP-hjælpercelle, der indeholder de genomiske adenovirale elementer nødvendige for at forbedre recPVs produktion samt parvoviros VP gen enhed ^5. Anvendelsen af Ad-VP-helper tillader fremstilling af rec-PV'er anvendelse af en protokol, der udelukkende afhænger virusinfektion trin (i modsætning til plasmid transfektion), gør det muligt at anvende cellelinier, der er vanskelige at transficere (f.eks NB324K) ( figur 2). Vi præsenterer en fremgangsmåde, der forbedrer i høj grad mængden af rekombinant virus produceret, hvilket reducerer både produktionstid og omkostninger uden at påvirke kvaliteten af slutproduktet ^5. Desuden er produktion i stor skala af recPV (i suspensionskulturer celler og bioreaktorer) nu tænkelige.

Protocol

Bemærk, at et laboratorium med en biosikkerhed niveau 2 er nødvendig for produktion af rekombinante parvovirus (recPV).

Protokollen er opdelt i to hoveddele. Den første del (produktion af recPV via transfektion) er nødvendig for at producere den minimale mængde recPVs, der fungerer som inokulum i anden del af protokollen (produktion af recPVs via infektion). Når først en lille mængde recPVs fremstilles, den første del af protokollen kan udelades, og det rekombinante parvovirus kan amplificeres kun via infektion tilvejebringe genet, der koder for parvovirus capsidproteinerne gennem adenovirale hjælpefunktion (se nedenfor).

1. Produktion af recPVs via transfektion

1,1 Viral DNA-transfektion

Det er muligt at anvende et anerkendt DNA-transfektion metoden i denne del af protokollen enten baseret på kationiske lipider eller calcium fosfat. Vi plejer at bruge Fugene HD transfektionsreagens. For at styre transfektionseffektiviteten, anbefaler vi at transficering ekstra plade med et plasmid udtrykker forbedret Green Fluorescent Protein (f.eks pEGFP-N1, Clontech). Transfektion anses en effektiv og optimal for virusproduktion når mindst 50% af cellepopulationen resulterer EGFP-positive 24 timer efter transfektion.

1. 1 dag før transfektion frø 2 millioner HEK293T celler i en 10 cm plade, for at opnå 50% cellulær konfluens på dagen for transfektion. Dyrke celler i 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med tilsætning af 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U per ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
2. Fremstille virus-fremstilling blanding (01:02:01 molforhold) i en 1,5 ml rør:
   1. 3 ug recPV vektor, der huser transgen af interesse (EI PhH-1-GFP ^6).
   2. 6 ug vektor pCMV / VP ⁵ huser parvovirus capsid-genet enhed
   3. 8 ug of adenovirus-afledte helper plasmid pXX6 ^7.
3. Fortynd plasmider blandes med serumfrit medium op til 850 pi (slutkoncentration på 20 ng / ul).
4. Tilsættes 42,5 gl Fugene HD (2,5:1 forhold pi Fugene: ug DNA). Rør ikke ved siden af ​​røret, når tilføjer Fugene til mediet.
5. Vortex forsigtigt i 5-10 sekunder.
6. Inkuberes blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter.
7. Tilføj transfektion blandinger dråbevis til cellerne. Ryste pladen forsigtigt for at fordele blandingen igennem.

1,2 Virusproduktion

1. Inkubér pladen ved 37 ° C med 92% fugtighed og _5% CO2 i 72 timer før høst. I denne periode afkom parvovirus partikler dannet ud fra de parvovirus plasmider.

1,3 Virus høst

1. I en vævskultur hætte, skrabe cellerne i deres medium, aspireres og overføre suspensionen fra pladen i en 15ml plastrør.
2. Centrifuger røret ved 250 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
3. Fjerne 95% af supernatanten.
4. Vortex røret forsigtigt at resuspendere pelleten i den resterende supernatant (ca. 0,5 ml).
5. Fryse røret ved -80 ° C. Det er muligt at stoppe produktionen på dette trin eller fortsætte med protokollen.
6. Afrime suspension og bringe den ved stuetemperatur.
7. Fryse suspension i et flydende nitrogen-bad og tø i varmt vand ved 37 ° C. Vortex rørene kraftigt i 15 sekunder og gentage frysning-optøningscyklus yderligere to gange.
8. Centrifuger rørene ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
9. Opsamle supernatanten til et frisk rør. Røret ved dette trin indeholder det rå virus ekstrakt præparat.
10. Fortsæt med virustitrering (se nedenfor). For recPV bærer GFP-genet, bør en typisk fremstilling opnåelse 1-3 x 10 ⁷ virale infektiøse enheder svarende til omkring 1 -3 x ¹⁰ 10 virale genom, der indeholder partikler.

1,4 Virus opbevaring

1. For langtidslagring fryse røret indeholdende det rå virus ekstrakt ved -80 ° C. Det er muligt at anvende rå virale ekstrakter som inokulum i den anden del af protokollen.

2. Produktion af recPVs via infektion

Før start med recPV produktion via infektion producere og oprense adenovirus 5 bærer parvovirus VP-genet (Ad-VP hjælper, beskrevet i ⁵⁾ ifølge standard protokol ^8. Det er også nødvendigt at have en minimal mængde af recPVs bærer transgenet af interesse (f.eks fremstilles via transfektion som beskrevet ovenfor).

Her beskriver recPV produktion i 175 ^cm2 kolbe (T175) format. Yderligere amplifikation af virus produceret på denne måde kan udføres i 10 flerlagede CellSTACK kultur kamre (Corning)med mindre justeringer af protokollen foreslået.

2,1 Infektion

1. 1 dag før infektion plade 10 millioner NB324K celler i en T175 kolbe til opnåelse af 60-80% cellulær konfluens på dagen for infektion. Fremstilling af en anden kolbe indeholdende det samme antal celler som en kontrol (ikke-inficerede celler). Hver T175 bør have 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) som et slutvolumen, suppleret med 5% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 E pr ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
2. Den næste morgen fremstille virus blandingen i en 2 ml plastrør, der består af:
   1. Ad-VP-hjælpercelle ⁵ ved multiplicitet af infektion (MOI, infektiøse enheder / celle) = 10 (svarende til 1 x 10 ⁸ infektiøse enheder);
   2. recPVs ved MOI = 0,5 (svarende til 5 x 10 ⁶ infektiøse enheder). Komplet til 1,5 ml med MEM.
3. Anvende hele virus blandingen i en af ​​T175 kolben.
4. Inkubérkolbe i 2 timer ved 37 ° C, 92% fugtighed, _5% CO2 forsigtig rystning hvert 15. minut.
5. Inkuberes i yderligere 20-24 timer ved 37 ° C, 92% fugtighed, _5% CO2.
6. Udskift kulturelt medium med frisk medium.

2,2 Virusproduktion

Inkuberes kolberne ved 37 ° C med 92% fugtighed og _5% CO2 i 48 timer. Som indikation for effektiv viral produktion, skal klare tegn på cytotoksicitet ses i kolben indeholdende virale inficerede celler, begyndende 36-48 timer efter infektion.

2,3 Virus høst

1. I en vævskultur hætte, aspireres og overføre mediet supernatanten fra kolben i et 50 ml centrifugerør.
2. Vask cellerne to gange med 1,5 ml PBS.
3. Trypsinisér cellerne med 1,5 ml 0,25% trypsin-EDTA. Tilsættes cellesuspensionen til fjernet medium.
4. Centrifugeres cellerne, og supernatanten ved 5000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur temperamentratur.
5. Supernatanten.
6. Tilsæt 1 ml TE-buffer (1 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) til cellepelleten og forsigtigt vortex røret for at resuspendere cellerne.
7. Fryse cellesuspension i et flydende nitrogen-bad og tø i varmt vand ved 37 ° C. Vortex røret kraftigt i 15 sekunder og gentage frysning-optøningscyklus tre gange.
8. Behandle cellesuspensionen med 50 U / ml Benzonase nuklease i 30 minutter ved 37 ° C for at fordøje cellen genomiske og ikke-pakkede virale DNA'er.
9. Centrifuger røret ved 5000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
10. Opsamle supernatanten til et frisk rør. Supernatanten ved dette trin indeholder det rå virus ekstrakt præparat. Typiske udbytter af recPV-GFP fremstillet efter denne protokol skal være i området 1-10 x 10 ⁸ virale infektiøse enheder.

2,4 Virus opbevaring

1. For kort sigt opbevaring (maks. 2 måneder), gem virus ved 4 ° C.
2. For long langtidsopbevaring (længere end 2 måneder), gem virus ved -80 ° C.

3. RecPV Oprensning

1. Til rensning af recPVs fra rålysater, anbefaler vi at køre en iodixanol diskontinuerlig gradient i henhold til Zolotukhin et al. ^9. Vi anbefaler at bruge et minimum af 5 ml af rå viral ekstrakt (fås fra produktion i fem T175 kolber) for effektiv virus rensning.

4. Rekombinant Parvovirus Titrering

1. Udføre recPV titrering som beskrevet i El-Andaloussi et al. ⁵

5. Kvalitet Controls

1. Anvender protokollen beskrevet i El-Andaloussi et al. ⁵ for at kontrollere for tilstedeværelsen af uønskede replikationskompetente virus (AN) udfører parvovirus plaqueanalyse i NB324K indikatorceller.

6. Repræsentative resultater

Et eksempel på recPVs production via transfektion i nærvær eller fravær af adenovirale, genomiske elementer er vist i figur 3. Celler blev transficeret med pCMV / VP (plasmid, der bærer genet, der koder for VP parvovirus capsidproteiner) sammen med PhH-1-GFP (en recPV huser GFP-genet) eller PhH-1-luciferase (en recPV huser ildflue-luciferasegenet) , med (+ pXX6) eller uden (-pXX6) i pXX6 plasmidet (der bærer adenovirus E2a, E4 (ORF6) og VA RNA-gener). Lige volumen af rå celleekstrakter blev påført NB324K celler og GFP-transduktion eller luciferase assays blev udført som beskrevet i El-Andaloussi et al. ^5. En klar stigning i recPVs produktion blev opnået i nærvær af pXX6 med produktionen øges fra 0,3 GFP transductional enheder (TU) / celle opnået i overensstemmelse med konventionelle protokoller til cirka 5 TU / celle opnået efter vores fremgangsmåde (fig. 3A, B). En signifikant stigning (ca. 24 gange) af recPV production blev også observeret i tilfælde af PhH-1-luciferase (fig. 3C). Disse resultater indikerer, at det genetiske materiale er indeholdt i pXX6 er i stand til at øge parvovirus produktion.

Et repræsentativt eksempel på recPVs produktion via infektion er vist i figur 4. NB324K celler blev co-inficeret med forskellige recPVs (som vist i figuren) og Ad-VP-hjælper (der huser det gen, der koder for de PV VP capsidproteinerne). Ad-VP helper yderligere forbedret recPV produktion op til> 70 TU pr podet celle (Fig. 4A) uden at forøge forekomsten af uønskede replikationskompetente virale partikler (fig. 4B).

Figur 1. Vektorer baseret på autonome parvovira. (A) Top: Transgenet erstatter en del af VP-kodende gener og er under kontrol af den virale promotor P38. Generne for NS1 / 2 er regeholdes og deres ekspression styres af viral promotor P4. Vektorgenomet flankeres af parvoviral ITR'erne, der indeholder cis-virkende elementer, som er nødvendige for replikation og pakning af den rekombinante genom. Bund: Et plasmid, der bærer VP-genet under enten en heterolog (fx CMV.) Eller autologe (fx P38.)-Promotoren (Px) tilføres i trans under rekombinant parvovirus produktion for at kompensere for afbrydelse af de strukturelle gener i det rekombinante genom. ITR, inverteret terminal repeat. Figur tilpasset fra ^4. (B) Skematisk afbildning af den klassiske protokol, der anvendes til fremstilling af recPVs. HEK293T celler transient transficeret med viral DNA (vektor og hjælper plasmider), og efter tre dage blev celler opsamlet og virus høstes.

Figur 2. Produktion af recPVs medhjælp fra Ad-VP. (A) Skematisk kort over recPV og Ad-VP genomer. Den recPV indeholder en heterologt transgen, der erstatter en del af VP-regionen. Ad-VP huser det parvovirus VP-genet. (B) Skematisk afbildning af protokollen beskrevet i dette skrift. NB324K celler er co-inficeret med recPV og Ad-VP virus. Efter tre dage høstes cellerne, og recPV partikler udvindes fra cellelysat.

Figur 3. Stimulering af recPV produktion af adenovirus-baserede plasmider pXX6. HEK293T celler podet i 10 cm skåle og blev transficeret med pCMV / VP i kombination med PhH-1-GFP (A og B) eller PhH-1-luciferase (C) til fremstilling recPVs. Samtidig blev celler co-transficeret med adenovirus-afledte hjælperceller plasmider pXX6 eller ej, som angivet. Tre dage efter transfektion blev cellerne høstet og lyseret ved tre fryse-og optøningscykler. Lige volumener af CRUDE virus ekstrakter blev påført NBK indikatorcellerne, og transduktion assays blev udført. (A) Repræsentative mikrografer, der viser GFP-positive celler i konfluente NB324K monolag. (B) Kvantificering af GFP-transduktion assays udtrykt i transduktion enhed (TU) pr podet celle . (C) Kvantificering af luciferaseaktiviteten udtrykt som relative luciferase enheder (RLU). Luciferase assay blev udført som beskrevet i El-Andaloussi et al. ^5. Søjlerne repræsenterer middelværdier fra tre gentagelser med standardafvigelse stænger. Antal oven på + pXX6 kolonne, (B og C), viser fold stigning i recPV virustitere, der blev opnået i nærvær af pXX6 versus uden.

Figur 4. Stimulering af recPV produktion ved hjælp af rekombinant Ad-VP hjælpevirus. (A) NB324K celler blev infektiTED med renset Ad-VP hjælper virus ved MOI på 10 (Ad-X enhed / celle, titreret med Adeno-X Rapid Titer Kit), og derefter superinficeres med et af følgende rekombinante parvovirus Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / celle) eller H-1-GFP (0,5 TU / celle) ^5. En dag efter infektion blev mediet skiftet, og to dage senere blev celler opsamlet og lyseret ved hjælp af tre fryse-og optøningscyklusser. Rå celleekstrakter blev anvendt til at bestemme virustitere ved transduktion assay ifølge El-Andaloussi et al. ^5. TU transduktion enhed. (B) Virale partier fremstillet i nærvær eller fravær af Ad-VP blev analyseret for deres indhold af replikationskompetente viruspartikler (AN) ved plakanalyse på NB324K indikatorceller.

Discussion

Vi har vist, at recPV produktion kan forøges ved tilstedeværelsen af ​​adenoviralt, genomisk elementer. Vi har forøget recPV udbytter på mere end 10 fold (fra 0,3 til 5 TU / celle) ved at tilvejebringe adenovirus genome elementet via transfektion og med mere end 100 fold co-infektion af cellerne med Ad-VP-helper i kombination med recPV i Sammenlignet med konventionelle protokoller. Protokollen beskrevet her, kan optimeres yderligere ved at bestemme den mest hensigtsmæssige tidspunkt for levering af de adenovirale, genomiske elementer og den optimale koncentration af Ad-VP hjælper til at blive anvendt til infektion.

RecPVs med større transgener (mere end 1.600 baser) er mindre effektivt produceret. Dette skyldes sandsynligvis den kendsgerning, at ved at indsætte transgenet, er cis-virkende elementer er nødvendige for PV korrekt viral DNA emballage fjernet. Den optimale størrelse af transgen, der kan indsættes i PV genomet uden at påvirke produktionen er op til 700 bunds ^6. Også slags af det indsatte transgen kan påvirke recPV produktion (f.eks. Insertion af gener, der koder for cytotoksiske proteiner, kan resultere i lavere recPV udbytter).

Et andet vigtigt aspekt at tage i betragtning under recPVs produktion er mulig forekomst af replikationskompetente virus (AN), som kan spontant dannes ved hjælp af homolog rekombination mellem det rekombinante parvovirus og VP-holdige plasmider. Den foreliggende protokol ikke forbedre rekombination risiko. Ikke desto mindre en AN kvalitetskontrol bør rutinemæssigt udføres (f.eks. Plakassay i NB324K indikator celler ⁵⁾ ved afslutningen af produktionen for at sikre, at virale lagre kun indeholde en ubetydelig mængde af RCV.

Den beskrevne protokol overvinder tidligere begrænsninger i valget af pakkecellelinie anvendes linie, som det gør det muligt at anvende cellelinier, der er vanskelige at transficere (ogderfor ikke egnet til protokoller baseret på transfektion), men er gode producenter af PVS. f.eks. NB324K celler ^10, som i vore hænder var mere effektive i at producere recPVs end HEK293T (data ikke vist). En screening af forskellige cellelinjer er nu muligt at anvende den nye protokol, og kunne identificere mere effektive celler til recPV produktion. Det baner også vejen for yderligere udforskning af systemet i stor skala produktion af rekombinant parvovirus f.eks. i bioreaktorer med celler i suspension.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250