Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l'aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

Summary

Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l'efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).

Abstract

Parvovirus roditori (PV) come H-rat 1PV e MVM, sono piccoli icosaedrica, virus a singolo filamento di DNA. La loro genoma comprende due promotori P4 e P38 che regolano l'espressione di proteine ​​non strutturali (NS1 e NS2) e capside (VP1 e VP2) rispettivamente ^1. Attirano grande interesse come agenti antitumorali per le loro capacità e oncolitici oncosuppressive pur essendo non patogeno per gli esseri umani ^2. NS1 è l'effettore maggiore di ³ citotossicità virale. Per migliorare ulteriormente le attività antineoplastici naturali, derivati ​​da questi vettori sono stati generati sostituendo il gene che codifica per le proteine ​​del capside di un transgene terapeutico (ad esempio un polipeptide citotossico, citochine, chemochine, gene soppressore del tumore, ecc) ^4. I parvovirus ricombinanti (recPVs) vettore mantiene le NS1 / 2 e le sequenze codificanti telomeri genoma PV che sono necessari per l'amplificazione del DNA virale e confezionamento. ProduzionerecPVs verifica solo nelle cellule produttrici (generalmente HEK293T) mediante co-trasfezione delle cellule con un vettore secondo (pCMV-VP) che esprime il gene che codifica per le proteine ​​VP (Fig. 1) ^4. I vettori recPV generati in questo modo sono replica difettosi. Anche se recPVs dimostrato di possedere attività oncotoxic avanzate rispetto ai virus parentali da cui sono stati generati, la loro produzione resta una sfida importante e ostacola fortemente l'uso di questi agenti in applicazioni cliniche anti-cancro.

Abbiamo trovato che l'introduzione di un vettore Ad-5 derivata contenente il E2a, E4 (ORF6) ed i geni RNA VA (es pXX6 plasmide) in HEK293T migliorato la produzione di recPVs di oltre 10 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Sulla base di questa scoperta, abbiamo costruito un nuovo Ad-VP-helper che contiene gli elementi necessari genomici adenovirali per aumentare la produzione recPVs nonché la parvovirci VP gene unità ^5. L'uso di Ad-VP-helper, consente la produzione di racco-PV utilizzando un protocollo che si basa interamente su gradini infezione virale (al contrario di trasfezione plasmide), rendendo possibile l'uso di linee cellulari che sono difficili da trasfettare (es NB324K) ( Fig. 2). Presentiamo un metodo che migliora notevolmente la quantità di virus ricombinante prodotto, riducendo sia i tempi e costi di produzione, senza compromettere la qualità del prodotto finale ^5. Inoltre, la produzione su larga scala di recPV (in cellule in sospensione e bioreattori) è concepibile.

Protocol

Si noti che un laboratorio con un livello di biosicurezza 2 è necessario per la produzione di parvovirus ricombinanti (recPV).

Il protocollo è suddiviso in due parti principali. La prima parte (produzione di recPV tramite trasfezione) è necessaria per produrre la quantità minima di recPVs che serve come inoculo nella seconda parte del protocollo (produzione di recPVs tramite infezione). Una volta che una piccola quantità di recPVs viene prodotta, la prima parte del protocollo può essere omesso, e il parvovirus ricombinante può essere amplificato solo tramite infezione fornire il gene che codifica per le proteine ​​del capside di parvovirus attraverso l'adenovirus helper (vedi sotto).

1. Produzione di recPVs tramite Transfection

1,1 transfezione di DNA virale

È possibile utilizzare qualsiasi metodo stabilito transfezione di DNA in questa sezione del protocollo sia basato su lipidi cationici o fosfato di calcio. Generalmente usiamo Fugene HD Transfection Reagent. Per controllare l'efficienza di trasfezione, si consiglia di transfezione targhetta supplementare con un plasmide che esprime una maggiore proteina fluorescente verde (ad es pEGFP-N1, Clontech). La trasfezione è considerata efficace e ottimale per la produzione di virus quando almeno il 50% della popolazione cellulare risulta EGFP-positivi 24 ore dopo la trasfezione.

1. 1 giorno prima della transfezione, semi di 2 milioni di cellule HEK293T in un piatto di 10 cm, per ottenere 50% di confluenza cellulare fino al giorno di trasfezione. Crescere le cellule in 10 ml di Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) con l'aggiunta del 10% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100 U per ml penicillina e 100 pg / ml di streptomicina.
2. Preparare virus processo miscela (1:2:1 rapporto molare) in una provetta 1,5 ml:
   1. 3 pg di vettore recPV ospitare il transgene di interesse (EI PhH-1-GFP ^6).
   2. 6 pg di vettore pCMV / VP ⁵ ospitante il capside unità parvovirus gene
   3. 8 mcg of adenovirus helper derivato da plasmide pXX6 ^7.
3. Diluire la miscela plasmidi con terreno privo di siero fino a 850 (concentrazione finale di 20 ng / pl) pl.
4. Aggiungi 42,5 ul Fugene HD (2.5:1 Fugene ul ratio: DNA microgrammi). Non toccare il lato del tubo quando si aggiunge Fugene al mezzo.
5. Vortex delicatamente per 5-10 secondi.
6. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.
7. Aggiungere le miscele di transfezione goccia a goccia per le cellule. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente l'impasto in tutto.

1,2 Virus produzione

1. Incubare la piastra a 37 ° C con 92% di umidità e 5% CO ₂ per 72 ore prima della raccolta. Durante questo periodo particelle parvovirus progenie sono formate dai plasmidi parvovirus.

1,3 Virus raccolta

1. In una cappa coltura tissutale, raschiare le cellule nel loro media, aspirare e trasferire la sospensione dalla piastra in 15plastica ml provetta.
2. Centrifugare la provetta a 250 xg per 5 min a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il 95% del supernatante.
4. Vortex delicatamente il tubo per risospendere il pellet nel supernatante residuo (circa 0,5 ml).
5. Congelare il tubo a -80 ° C. E 'possibile interrompere la produzione in questa fase, o per continuare con il protocollo.
6. Sbrinare la sospensione e portarlo a temperatura ambiente.
7. Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido e disgelo in acqua calda a 37 ° C. Agitare vigorosamente per 15 secondi e ripetere i cicli di gelo-disgelo altre due volte.
8. Centrifugare le provette a 16000 xg per 15 min a 4 ° C.
9. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Il tubo in questa fase contiene la preparazione dell'estratto grezzo virus.
10. Procedere con la titolazione virus (vedi sotto). Per la recPV porta il gene GFP, una produzione tipica dovrebbe dare 1-3 x 10 ⁷ unità virali infettive corrispondenti a circa 1 -3 x ¹⁰ 10 genoma virale contenente particelle.

1,4 Virus stoccaggio

1. Per la conservazione a lungo termine congelare il tubo contenente l'estratto grezzo virus a -80 ° C. E 'possibile utilizzare estratti grezzi virali come inoculo nella seconda parte del protocollo.

2. Produzione di recPVs tramite infezione

Prima di iniziare con la produzione recPV via infezione, produrre e purificare adenovirus 5 che porta il parvovirus VP gene (VP Ad-helper, descritto in ⁵⁾ secondo il protocollo standard ^8. È inoltre necessario avere una minima quantità di recPVs trasportano il transgene di interesse (ad esempio, prodotta tramite trasfezione come descritto sopra).

Di seguito, descriviamo la produzione recPV in 175 cm ² pallone (T175) formato. Ulteriore amplificazione dello stock di virus prodotta in questo modo può essere condotta in 10 camere di coltura multistrato CellSTACK (Corning)con modifiche minime del protocollo proposto.

2,1 Infezione

1. 1 giorno prima infezione, piatto 10 milioni di cellule NB324K in un pallone T175 di ottenere il 60-80% di confluenza cellulare al giorno di infezione. Preparare un secondo pallone contenente lo stesso numero di cellule come un controllo (cellule non infette). Ogni T175 dovrebbe avere 20 ml di Medium minimo (MEM) come un volume finale, supplementato con 5% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100U per Penicilin ml e 100 pg / ml di streptomicina.
2. La mattina successiva preparare miscela virus in una provetta di plastica 2 ml costituito da:
   1. Ad-VP-helper ⁵ a molteplicità di infezione (MOI, unità infettive per cellula) = 10 (corrispondente a 1 x 10 ⁸ unità infettive);
   2. recPVs a MOI = 0,5 (corrispondente a 5 x 10 ⁶ unità infettive). Completa a 1,5 ml con MEM.
3. Applicare la miscela virus in un pallone T175.
4. Incubare lapallone per 2 ore a 37 ° C, 92% di umidità, 5% CO ₂ agitando delicatamente ogni 15 min.
5. Incubare per ulteriori 20-24 ore a 37 ° C, 92% di umidità, 5% CO _2.
6. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco.

2,2 Virus produzione

Incubare le fiasche a 37 ° C con 92% di umidità e 5% CO ₂ per 48 ore. Come indicazione di efficiente produzione virale, chiari segni di citotossicità deve essere osservata nel pallone contenente virali cellule infettate, a partire da 36-48 ore dopo l'infezione.

2,3 Virus raccolta

1. In una cappa coltura tissutale, aspirare e trasferire il supernatante mezzo dal pallone in una provetta da centrifuga 50 ml.
2. Lavare le cellule due volte con 1,5 ml di PBS.
3. Tripsinizzare le cellule con 1,5 ml di 0,25% Trysin-EDTA. Aggiungere la sospensione cellulare al mezzo rimosso.
4. Centrifugare le cellule e il surnatante a 5000 xg per 5 min a carattere cameraperatura.
5. Eliminare il surnatante.
6. Aggiungere 1 ml di tampone TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) al pellet e delicatamente vortice la provetta per risospendere le cellule.
7. Blocca la sospensione cellulare in un bagno di azoto liquido e disgelo in acqua calda a 37 ° C. Vortex la provetta vigorosamente per 15 secondi e ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento tre volte.
8. Trattare la sospensione cellulare con 50 U / ml Benzonase nucleasi per 30 min a 37 ° C per digerire il DNA genomico delle cellule e virali non-confezionati.
9. Centrifugare la provetta a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C.
10. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Il supernatante in questa fase contiene la preparazione dell'estratto grezzo virus. Le rese di recPV-GFP prodotta seguendo il protocollo dovrebbe essere nell'intervallo di 1-10 x 10 ⁸ unità virali infettive.

2,4 Virus stoccaggio

1. Per stoccaggio a breve termine (massimo 2 mesi), virus conservare a 4 ° C.
2. Per long conservazione a lungo termine (più di 2 mesi), virus conservare a -80 ° C.

3. RecPV Purificazione

1. Per la purificazione delle recPVs dai lisati di greggio, si consiglia di eseguire un gradiente discontinuo Iodixanolo secondo Zolotukhin et al. ^9. Si consiglia di utilizzare un minimo di 5 ml di greggio estratto virale (ottenuto dalla produzione in cinque palloni T175) per la purificazione del virus efficiente.

4. Parvovirus titolazione ricombinante

1. Eseguire la titolazione recPV come descritto nella El-Andaloussi et al. ⁵

5. Controlli di qualità

1. Utilizzare il protocollo descritto in El-Andaloussi et al. ⁵ per verificare la presenza di virus replica indesiderati competenti (AN) che effettuano test parvovirus placca in cellule indicatrici NB324K.

6. Risultati rappresentativi

Un esempio di recPVs production tramite trasfezione in presenza o assenza di elementi genomiche adenovirus è mostrato in Figura 3. Le cellule sono state trasfettate con pCMV / VP (plasmide trasportante il gene che codifica per le proteine ​​del capside di parvovirus VP) insieme PhH-1-GFP (uno recPV ospitante il gene GFP) o PhH-1-luciferasi (uno recPV ospitante il gene della luciferasi di lucciola) , con (+ pXX6) o senza (-pXX6) pXX6 il plasmide (che porta il adenovirus E2A, E4 (ORF6) e VA geni RNA). Volume uguale di estratti cellulari grezzi sono stati applicati a NB324K cellule e trasduzione GFP o saggi di luciferasi sono state eseguite come riportato in El-Andaloussi et al. ^5. Un netto aumento della produzione recPVs è stato ottenuto in presenza di pXX6 con produzione crescente da 0,3 unità GFP trasduzionali (TU) / cellulare ottenuta secondo protocolli convenzionali, circa 5 TU / cellulare ottenuta seguendo il metodo (Fig. 3A, B). Un aumento significativo (circa 24 volte) di recPV productisu stata osservata anche nel caso di PhH-1-luciferasi (Fig. 3C). Questi risultati indicano che il materiale genetico contenuto in pXX6 è in grado di incrementare la produzione parvovirus.

Un esempio rappresentativo di produzione recPVs tramite infezione è mostrato in Figura 4. NB324K cellule sono state co-infettati con recPVs vari (come indicato in figura) e Ad-VP-helper (ospitare il gene che codifica per le proteine ​​del capside VP PV). Ad VP-helper produzione ulteriormente migliorato recPV fino a> 70 TU per semi cellule (Fig. 4A), senza aumentare la comparsa di indesiderati replicazione particelle virali (Fig. 4B).

Figura 1. Vettori base parvovirus autonomi. (A) Top: Il transgene sostituisce parte del VP geni codificanti ed è sotto il controllo del promotore P38 virale. I geni per NS1 / 2 sono ricontenute e la loro espressione è controllata dal promotore virale P4. Il genoma del vettore è fiancheggiato da ITR parvoviral, che contengono elementi cis-agenti che sono richieste per la replicazione e confezionamento del genoma ricombinante. Basso: Un plasmide che porta il gene sotto-VP o un eterologo (ad esempio CMV.), O autologo (es P38.) Promotore (Px), viene fornita in trans durante la produzione ricombinante parvovirus per compensare per la distruzione dei geni strutturali nel genoma ricombinante. ITR, ripetizione terminale rovesciato. Figura adattato da ^4. (B) Rappresentazione schematica del protocollo classico utilizzato per la produzione di recPVs. HEK293T cellule sono transitoriamente trasfettate con DNA virale (vettore e plasmidi helper) e dopo tre giorni, le cellule vengono raccolte e virus raccolto.

Figura 2. Produzione di recPVs con lal'aiuto della Ad-VP. (A) mappe schematiche di genomi recPV e Ad-VP. Il recPV contiene un transgene eterologa che sostituisce parte della regione VP. L'Ad-VP ospita il gene parvovirus VP. (B) Rappresentazione schematica del protocollo descritto in questo manoscritto. Cellule NB324K sono co-infettati con recPV e Ad-VP virus. Dopo tre giorni le cellule vengono raccolte e particelle recPV recuperato dal lisato cellulare.

Figura 3. Stimolazione della produzione di recPV da adenovirus-based plasmidi pXX6. Cellule HEK293T, seminate in 10 piatti cm, sono state trasfettate con pCMV / VP in combinazione con PhH-1-GFP (A e B) o PhH-1-luciferasi (C) per produrre recPVs. Contemporaneamente, le cellule sono state co-trasfettate con i plasmidi derivati ​​da adenovirus helper pXX6 o meno, come indicato. Tre giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e lisate mediante tre cicli di congelamento e scongelamento. Volumi uguali di CRUDestratti di Virus e sono stati applicati a NBK cellule indicatrici, e saggi di trasduzione sono stati effettuati. (A) micrografie rappresentativi mostrano cellule GFP positive all'interno NB324K monostrati confluenti. (B) Quantificazione dei saggi di trasduzione del GFP espressa in unità di trasduzione (TU) per cella semi . (C) quantificazione dell'attività luciferasica espressa come unità luciferasi relative (RLU). Il saggio luciferasi è stata eseguita come descritto in El-Andaloussi et al. ^5. Le colonne rappresentano i valori medi di tre repliche con barre di deviazione standard. Numero sulla parte superiore della colonna + pXX6, in (B e C), indica l'incremento volte in titoli virali le recPV, ottenuto in presenza di pXX6 rispetto senza.

Figura 4. Stimolazione della produzione di recPV mediante ricombinante Ad-VP virus helper. (A) cellule NB324K, erano infezioniTed purificato con Ad-VP virus helper a MOI di 10 (Ad-X unità / cell, titolato con Adeno-X Rapid titolo Kit), e poi superinfettati con una delle seguenti parvovirus ricombinante Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / cell) o H-1-GFP (0,5 TU / cell) ^5. Un giorno dopo l'infezione, mezzo è stato cambiato e due giorni dopo, le cellule sono state raccolte e lisate tramite tre freeze-e-scongelamento. Estratti cellulari grezzi sono stati usati per determinare i titoli virali mediante saggio di trasduzione secondo El-Andaloussi et al. ^5. TU, unità di trasduzione. (B) lotti virali prodotte in presenza di assenza di Ad-VP sono stati analizzati per il contenuto di particelle virali di replicazione (AN) mediante saggio di placca su cellule indicatrici NB324K.

Discussion

Abbiamo dimostrato che la produzione recPV può essere migliorata dalla presenza di elementi genomiche adenovirali. Abbiamo aumentato i rendimenti recPV da più di 10 volte (0,3-5 TU / cellula) fornendo genomico elemento adenovirus tramite trasfezione e da più di 100 volte co-infettando le cellule con Ad-VP-helper in combinazione con la recPV in rispetto ai protocolli convenzionali. Il protocollo qui descritto può essere ulteriormente ottimizzato determinando il tempo più appropriata per la fornitura di elementi genomiche dei adenovirus e la concentrazione ottimale di Ad-VP helper da utilizzare per l'infezione.

RecPVs transgeni con i più grandi (più di 1.600 basi) sono prodotte in modo meno efficiente. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che inserendo il transgene, elementi necessari per il confezionamento PV corretto DNA virale cis-agenti vengono rimossi. La dimensione ottimale del transgene che può essere inserito nel genoma PV senza compromettere la sua produzione è fino a 700 di bases ^6. Anche il tipo del transgene inserito può influenzare la produzione di recPV (ad es. Inserimento di geni che codificano per le proteine ​​citotossici può causare una riduzione dei rendimenti recPV).

Un altro aspetto importante da prendere in considerazione durante la produzione recPVs è la possibile comparsa di virus replica competenti (AN) che potrebbe essere formata spontaneamente attraverso la ricombinazione omologa tra il parvovirus ricombinante e VP contenenti plasmidi. Il protocollo attuale non aumentare il rischio di ricombinazione. Tuttavia un controllo di qualità AN deve essere eseguita di routine (ad es. Saggio con placca in cellule indicatrici NB324K ⁵⁾ alla fine della produzione per assicurare che gli stock virali contengono solo una quantità trascurabile di RCV.

Il protocollo descritto supera precedenti limitazioni nella scelta della linea cellulare di confezionamento utilizzato, in quanto rende possibile l'utilizzo di linee cellulari che sono difficili da trasfettare (equindi non adatto basato su protocolli di trasfezione), ma sono buoni produttori di PV. es. Cellule NB324K ¹⁰ che nelle nostre mani più efficiente nella produzione di recPVs HEK293T (dati non mostrati). Uno screening di diverse linee cellulari è ora possibile applicare il nuovo protocollo, e potrebbe identificare le celle più efficienti per la produzione di recPV. Questo apre anche la strada a ulteriori esplorazioni del sistema di produzione su larga scala per esempio di parvovirus ricombinante. in bioreattori con cellule in sospensione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Sigma-Aldrich	M4655
F–tal Bovine Serum	PAA Laboratories	A15-101
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030-024
Fugene	Roche Group	047097050001
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit	Clontech Laboratories	632250