Protokoll för könsceller transplantation och testiklar xenografting vävnad beskrivs. Könsceller transplantation resultat i givar-derived spermatogenes i mottagarländerna testiklar och representerar en funktionell beredning analys för identifiering av spermatogonial stamceller (SSC). Testikel vävnaden xenografting återger testiklar utveckling och spermatogenes av olika givare arter i mottagande möss.
Könscell transplantation har utvecklats av Dr Ralph Brinster och kollegor vid University of Pennsylvania i 1994 1,2. Dessa banbrytande studier visade att mikroinjektion av könsceller från bördiga donatormöss i sädeskanalerna av alla infertila mottagande möss resulterar i givaren härlett spermatogenes och spermieproduktion av mottagaren djuret 2. Användningen av donatordjur bär den bakteriella β-galaktosidasgenen möjliggjorde identifiering av givare härrörande spermatogenes och överföring av givare haplotypen till avkomman med mottagande djur 1. Helt överraskande, efter transplantation in i lumen av sädeskanalernas tubuli, voro transplanterade könscellerna kunna röra sig från den luminala avdelningen till den källaren membranet där spermatogonier är belägna 3. Det är allmänt godtas att förordningen enbart SSC: er är i stånd att kolonisera den nisch-och återupprätta spermatogenesen hos de mottagande testikel. Därför könscelltransplantation ger ett funktionellt synsätt för att studera den nisch stamceller i testiklarna och för att karakterisera förmodade spermatogonial stamceller. Till datum, är grodden celltransplantation användas för att belysa grundläggande biologi stamcell, att producera transgena djur igenom genetisk manipulering av könsceller före transplantation 4,5, för att studera Sertolicellen-grodden cell-interaktion 6,7, Rymdbolaget homing och kolonisering 3, 8, samt SSC självförnyelse och differentiering 9,10.
Könscell transplantation är också möjligt i stora arter 11. I dessa är de huvudsakliga användningsområdena är bevarandet av fertilitet, spridning av elit genetik i djurpopulationer, och generering av transgena djur som studiet av spermatogenes och SSC biologi med denna teknik är logistiskt svårare och dyrare än hos gnagare. Transplantation av könsceller från stora arter i sädeskanalerna av möss leder till colonization av donerade celler och spermatogonial expansion, men inte i sin fulla differentiering förmodligen på grund av inkompatibilitet mellan mottagaren somatiska cellen fack med könscellerna från fylogenetiskt avlägsna arter 12. Ett alternativt tillvägagångssätt är transplantation av könsceller från stora arter tillsammans med sin omgivning somatisk avdelning. Vi rapporterade först i 2002, att små fragment av testiklarna vävnad från omogna män transplanterade under dorsal huden immundefekta möss kan överleva och genomgå en fullständig utveckling med produktion av befruktning kompetent sperma 13. Sedan dess har testiklarna vävnad xenografting har visat sig vara framgångsrik i många arter och framträdde som ett värdefullt alternativ för att studera testiklar utveckling och spermatogenes av stora djur i möss 14.
1. Germ celltransplantation
Germ celltransplantation tillhandahåller den enda funktionell-analysen för otvetydig bekräftelse av närvaron av spermatogonial stamceller (SSC: er) i en cellpopulation. Endast SSC kan hem till och kolonisera SSC nisch vid basalmembranet och initiera donator-derived spermatogenesen. Könscell transplantation gjort det möjligt att studera och manipulera SSC på ett aldrig tidigare skådat sätt. Tekniken har använts för att framställa transgena djur genom gene…
The authors have nothing to disclose.
Arbete från författarna laboratoriet har fått stöd av USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) och Alberta innovativt – Health Solutions.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collagenase (type IV) | Sigma | C5138 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 |
DNaseI | Sigma | DN25 |
DMEM | Invitrogen | 31053-028 |
Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 |
Nylon mesh cell strainer | BD biosciences | 352340 (40μm) 352350 (70μm) |
Busulfan | Sigma | B2635 |
Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instrument | TW 100-3 |
BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD | CA-63018-725 |
Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon | 706G |
Wound clips | BD | 427631 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
X-gal | Sigma | B4252 |
Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 |
Potassium Ferricyanide | Sigma | P3667 |
magnesium chloride | Sigma | 208337 |
sodium deoxycholate | Sigma | D6750 |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Igepal CA-630 | Sigma | 18896 |