光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

Summary

我々は転移性疾患の早期指標として循環するメラノーマ細胞を検出するためにレーザー誘起超音波を用いてフローサイトメーターを開発しました。

Abstract

循環腫瘍細胞（CTCの）は巨視的な腫瘍から分離し、種子の二次腫瘍^1,2,3への血液やリンパ系を介して拡散しているそれらの細胞である。 CTCのは、転移性疾患の指標であると血液サンプル中のそれらの検出は、癌の診断と治療に対する患者の反応を監視するために使用されることがあります。 CTCのは稀なので、進行がん患者、それらの検出と列挙内の正常な血液細胞の十億の中の腫瘍細胞について、構成することは困難な作業です。我々は^4,5メラノーマ細胞（CMCの）循環を検出するためのカスタムフローサイトメーターでの超音波を誘導音響生成する最もメラノーマ細胞における色 ​​素の存在を利用する、またはレーザー。このプロセスは、遠心分離を使用し、白血球の層を得る全血検体を分離伴います。全血中に存在する場合、CMCは同じような密度のために白血球を分離します。これらの細胞を再懸濁するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と流量計に導入する。むしろ血液細胞懸濁液の連続的な流れよりも、我々は、さらなる研究のためにこれらの細胞を捕捉するために、二相流を誘導した。二相流では、マイクロ流体システムに2つの不混和液体は液体^6,7のナメクジを交互に接合し、フォームに会う。 PBSは、順番にレーザー光を照射している白血球や空気のフォームマイクロリットルのナメクジを中断。液相に界面活性剤の添加は、均一なスラグ形成を可能にし、ユーザーは、2つのフェーズの流量を変化させることによって、異なるサイズのナメクジを作成することができます。白血球と空気とPBSのナメクジのナメクジは光吸収剤を含まず、従って、光音響波を生成しない。しかしながら、単一のCMCを含む白血球のナメクジは、レーザー光を吸収し、高い周波数の音波を生成する。光音響波を生成するこれらのナメクジはverificのために隔離し、細胞化学染色のために収集されますCMCを注意深く検討する必要があります。

Protocol

1。血液サンプル調製

1. 2つの5 mLのvacutainersにIV期のがん患者から全血の約10 mLを描く。
2. 毎分3000回転（rpm）で10分間チューブを遠心する。
3. 血液サンプルは、3つの異なる層に分離されます。下部層は、また、 バフィコートと呼ばれる赤血球、中間層を含み、白血球およびメラノーマ細胞が含まれており、最上層は血漿および血小板が含まれています。バフィコートを乱すことなく、できるだけ多くのプラズマとして削除します。
4. 2つの1 mLのウイントローブ管のHistopaque 1077の代わりに250μL。
5. 9"パスツールピペットを使用して、<500μLを収集することを確認しながら、残りの血漿、全体バフィコート、さらに赤血球の最上層を抽出する。
6. Histopaque層の上にソリューションを配置し、3000rpmで10分間、15 mLコニカルチューブにウイントローブ管を遠心する。
7. 血液は再びれます独立したが、今回は、赤血球は、バフィコートの簡単な抽出を可能にする、Histopaqueで区切られます。全体のバフィコートを取得し、2 mLのエッペンドルフチュー​​ブに配置する9"パスツールピペットを使用してください。
8. 2パーセント/ VのTween20を含むPBS 1.5 mlのバフィーコートを一時停止する。

2。フローチャンバーの建設

1. アクリルシリンダー、20ミリメートル、外径17内径、および高さ8ミリメートルを取得します。互いに90度の角度で円筒の側面を介して3つの5 mm径の穴を開けます。ポリマーチューブの3枚（1.6内径5 mmの外径）を切断し、ドリル穴に入れます。
2. 水タイトなシールを作るためにアクリルリングの下部にパラフィルムを伸ばす。パラフィルムは、アクリルリングと浅いボウルを形成し、フローチャンバーを形成するアクリルアミド溶液を開催します。
3. の向かい側にあるチューブの部分を段階的に1.6 mmの直径のワイヤーを一時停止お互いは、単独で配線がリングの真ん中から見えるが認識するように。 1.6mmの直径のワイヤーと位置離れて一時停止線からチューブ1 mmのチューブの第三のピースを埋める。これらのワイヤは、チューブに入ることからアクリルアミドを防ぎます。アクリルアミドが固化した後、ワイヤーが光ファイバを配置する円筒状の流路と場所を残して、抽出される流路に焦点を当てています。
4. 小さなビーカーに準備アクリルアミドを5 mL [20 gのアクリルアミド（シグマアルドリッチ）、0.7 gのビスアクリルアミド（シグマアルドリッチ）、蒸留水100mL]を追加します。過硫酸アンモニウム（シグマ）の0.02グラムを測定し、ビーカーに追加します。 3分間撹拌棒で混ぜる。ビーカーに20μLtetramethylethylenediamene（フィッシャーサイエンティフィック）を追加します。すぐにトップに充填、アクリルリングに混合物を注ぐ。数秒後、溶液、ゲル、フローチャンバーの金型を作っています。慎重にアクリルアミドゲルを邪魔しないことを確認して、ワイヤーを引き出します。フローチャンバBERが使用できるようになりました。

3。光音響流量計のセットアップ

1. 音響的にカップルに直接流路の上に超音波ゲルを使用してフローチャンバーへのポリフッ化ビニリデン圧電音響トランスデューサ（パナメトリクス）。
2. バヨネットニール- Concelman（BNC）ケーブルを使用して、RITECブロードバンドレシーバ- 640Aの入力（：外、ハイパスフィルタ：1 MHzで、入力強度インピーダンス：50オーム、増幅：35デシベルローパスフィルター）への変換器を接続する。オシロスコープ（テクトロニクスTDS 2024B）にフィルタの出力を接続してください。オシロスコープをトリガするために、フォトダイオード（Thorlabsは）変換器の近くに設定されており、BNCケーブルを使用してオシロスコープに接続されている。
3. T -コネクタ（スモールパーツ）はフローチャンバーの一方のアームに取り付けられています。二つのシリンジポンプ（ブレーントリーサイエンティフィック）は、コネクタの他の支店に接続されています。他のパート1で調製した細胞懸濁液を含むのに対して、一つのシリンジは、空気を含んでいます。に流量を設定する100μL/分。
4. エアフォームの小さなポケットまで、フローチャンバーの小さいチューブを抽出し、そのスロットの0.37の開口数と直径1mmのコア光ファイバを挿入する。インタフェース信号を削減し、流路に適用されるレーザー光の量を増やすために水でポケットをいっぱいに。流路に光ファイバと短い距離の開口数のために、レーザーは、直接レーザーの目の前のサンプルでは、​​光音響信号を作成する場合は、サンプルであることを保証する、任意の時点でサンプルの一つスラグを照射します。レーザーのエネルギーは7 mm ²のスポットサイズで約28ミリジュール/ cm ^2とする必要があります。
5. シリンジポンプの両方をオンにします。 2つの不混和流体は、T字路に到達すると、彼らが均質ナメクジとトランスデューサ過去のフローに分割されます。
6. ナノ秒メラノーマ細胞における光音響波を生成するためにレーザーをパルスで流れる試料を照射する。メラニンはbroadbであるとしてと吸収光学、目に見えるレーザーの波長を使用することができます。
7. スラグは、トランスデューサーの上になったとき、信号がオシロスコープに表示される場合は、スラグには、黒色腫が含まれており、コレクションバイアルにドロップするまで、システムを介して追跡する必要があります。

4。免疫細胞化学

1. スライドガラスにそれらを修正するためにサイトスピン4セントリフュージ（サーモサイエンティフィック）にキャプチャしたナメクジを取る。場所のガラスはCytofunnels（ブラウンフィルターカードサーモサイエンティフィック社とシャンドンEZシングルCytofunnel）に挿入し、サイトスピン4遠心分離機にそれらをロードする。各漏斗にPBSで（シグマ）1％ウシ血清アルブミンの100μLを入れ、次に捕捉細胞はスライドガラスに付着するための3分間600rpmで遠心する。
2. 遠心分離後、Cytofunnelsに細胞サンプルを追加し、3分間600rpmで遠心する。その後、エタノールベースの​​固定液とスライドをスプレー。
3. 二回10分間PBSでスライドを洗浄します。
4. インキュベーション後、スライドをデカントし、室温で加湿チャンバー内で1時間一次抗体溶液でインキュベートする。各スライドには、1％ウサギで提起されたMART - 1抗体、1％マウスで育ったCD - 45抗体、10％ヤギ血清、89％PBSを含める必要があります。
5. インキュベーション後、10分を3回PBSでスライドを洗う。
6. スライドはその後、蛍光体抗体に結合した二次抗体溶液でインキュベートされる。混合物は0.05％ヤギ抗ウサギ抗体、0.05％のヤギ抗マウス抗体、0.1％ヤギ血清、99％PBSを含んでいます。スライドを室温で1時間、暗所でインキュベートする。
7. インキュベーション後、スライドを5分間PBSで3回洗浄デカントする。
8. 核のために染色する、のためにDAPI 0.1μg/ mLの（インビトロジェン社）で細胞をインキュベート1分。その後、スライドをデカントし、PBSで洗浄する。
9. スライドごとの樹脂ベース取付メディアの20μLを用いて細胞サンプル上にカバースリップをマウントします。スライドを維持するために明確なマニキュアでカバースリップをシール。今すぐスライドは蛍光顕微鏡で撮像される準備が整いました。

5。代表的な結果：

図1白血球やメラノーマ細胞からの光音響波形がここに表示されます。白血球は、ない固有の色素沈着のない、電子ノイズのフラットライン（左）とは光音響波とマニフェストを生成しません。色素性メラノーマ細胞は、強力な光音響波を（右）が生成されます。

図2：免疫細胞化学染色した後、培養メラノーマ細胞はBLにDAPIシグナルを示すMART1一方、UEは、緑色で強調表示されます。

図3。白血球の指標としてCD45と、図2に、DAPIとMART1用に画像をオーバーレイ、この図は、いくつかの白血球細胞の間でメラノーマ細胞を示しています。

Discussion

CTCを検出することはまれな腫瘍細胞を単離するのが難しい問題があるため、非常に少数の臨床応用でも、研究集約的な分野です。他の多くの技術がRT - PCR、マイクロセルのキャプチャ、免疫キャプチャ、および他の方法^8月12日を含めて、CTCの検出、のために評価されている。しかし、CMCのショーの光音響検出は、ラベルフリーで、小さな、光吸収粒子を捕捉するために迅速かつ正確な手段を提供するように約束。

白血球を分離するために記述されたプロトコルは、非常に効率的です、まだ赤血球の数値が低いほど、サンプルに存在している。これらルージュ混入細胞はまた、レーザー光を吸収するが、大幅に減少したレベル。赤血球は、当社の黒色腫の検出システムに干渉しないように、五健康な患者のサンプルは、システムを介して導入され、いずれも赤血球が十分に低い濃度で存在していることを示す、シグナルを明らかにしていない無視される。

濃度の一連の研究は、培養メラノーマ細胞を用いて行われていると光音響流のシステムがダウンして1セル/μL（未発表データ）に敏感な証明されています。これらの研究は継続にあり、すぐに癌の患者のサンプルを用いて試験が含まれます。

この光音響法はまた、外因性発色団を取り付けることで、乳癌や前立腺癌などの非色素CTCの、で使用するために評価されている。我々は癌cells13に金ナノ粒子を用いた予備作業を実行しました。これらのテストは、ナノ粒子は、光音響波を生成するために必要な光吸収を提供できることが示されている。残りの技術的課題は、選択的にがん細胞にこのような粒子を添付することです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234