Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

Summary

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Abstract

De zintuigen van de kip binnenoor worden geïnnerveerd door de perifere processen van statoacoustic ganglion (SAG) neuronen. Zintuig innervatie is afhankelijk van een combinatie van een axon begeleiding signalen ¹ en ² survival factoren gelegen langs het traject van de groeiende axonen en / of binnen hun zintuig doelen. Bijvoorbeeld, functionele interferentie met een klassieke axon begeleiding signaalweg, semaphorin-neuropilin, gegenereerd misrouting van otic axonen ^3. Ook verschillende groeifactoren, uitgedrukt in de sensorische doelstellingen van het binnenoor, waaronder neurotrofine-3 (NT-3) en Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF), zijn gemanipuleerd in transgene dieren, weer wat leidt tot misrouting van SAG axonen ^4. Deze zelfde moleculen bevorderen, zowel overleving en uitgroei van neurieten van kuiken SAG neuronen in vitro ^5,6.

We beschrijven hier en demonstreren van de in-vitro-methode die wij op dit moment are uzingen voor de responsiviteit van kuiken SAG neurieten test om oplosbare eiwitten, waaronder bekende morphogens zoals de Wnts, evenals de groei factoren die van belang zijn voor het bevorderen van SAG neurietuitgroei en neuron overleven. Met behulp van dit model systeem, hopen we conclusies over de effecten die uitgescheiden liganden kunnen uitoefenen op de SAG neuron overleving en neurietuitgroei trekken.

SAG explantaten worden ontleed op embryonale dag 4 (E4) en gekweekt in drie-dimensionale collageen gels onder serum-vrije omstandigheden gedurende 24 uur. Ten eerste is neurieten reactievermogen getest door het kweken van explantaten met eiwit-aangevuld medium. Dan, om te vragen of puntbronnen van uitgescheiden liganden kunnen directionele effecten op neurietuitgroei hebben, zijn explantaten samen gekweekt met eiwit-gecoate kralen en getest op het vermogen van de kraal om lokaal bevorderen of belemmeren uitgroei. We hebben ook een demonstratie van de dissectie (gewijzigde protocol ⁷⁾ en de cultuur van E6 ruggenmerg explantaten. Wijroutinematig gebruik van het ruggenmerg explantaten op bioactiviteit van de eiwitten en eiwit-doordrenkte kralen te bevestigen en te controleren soort cross-reactiviteit met chick weefsel, onder dezelfde voorwaarden als de cultuur SAG explantaten. Deze in vitro testen zijn handig voor het snel screenen op moleculen die trofische (overleving) of tropische (directionele) effecten op de SAG neuronen uit te oefenen, vooral vóór het uitvoeren van studies in vivo. Bovendien is deze methode maakt het testen van individuele moleculen onder serum-vrije omstandigheden, met een hoge neuron overleven ^8.

Protocol

Recepten

Chick Ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Water (weefselkweek graad)

Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng uiteindelijke volume tot 1000 ml met water.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC water

Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng finalevolume tot 500 ml met water. Werken concentratie (1X) wordt gemaakt door het verdunnen van een deel 10X voorraad met 9 delen van weefsel-cultuur kwaliteit water, zoals die verkregen met een Millipore UV-bestraling systeem om water te genereren met 18 MΩ cm geleidbaarheid.

SAG explantatie holding medium

• DMEM/F12 met L-glutamine, 10 mM Hepes
• 10% Insuline, overdragen, Selenium (ITS +1)
• 1% pen-strep

Explantatie kweekmedium

• SAG explantatie holding medium
• 10 ng / ml neurotrofine-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliaire neurotrofe factor (CNTF)

Ruggenmerg dissectie en het bedrijf medium

• L-15
• 10% foetaal kalf serum
• 1% pen-strep

Incubeer de eieren bij 37-38 ° C. Steriliseren ontleden gereedschappen en Sylgard ontleden schotel in 70% ethanol. Ontleden gerechten en tools kunnen ook worden 's nachts UV gesteriliseerd.

1. Plaats kralen in een microbuisjes met 1 ml steriele PBS, mix, en wacht tot de kralen om zich te vestigen op de bodem van de buis.
2. Was de kralen meerdere malen door het verwijderen van het supernatant na de kralen hebben gevestigd en resuspendeer in PBS.
3. Incubeer de kralen in gezuiverde eiwit (verdund in PBS) of PBS alleen (Control) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Spoel de kralen in PBS en bewaar in een 24-wells plaat met 1 ml PBS totdat geplaatst in collageen.

2. Statoacoustic ganglion dissectie

1. Op E4 verwijder het embryo uit het ei en plaats deze in een schaal met de oplossing chick Ringer om embryonale membranen te verwijderen.
2. Plaats het embryo in een Sylgard © bekleed petrischaal gevuld met koud HBSS en positie van het embryo op zijn kant met de otic blaasje naar boven. Speld de embryo de schaal met behulp ontleden pinnen.
3. Met behulp van twee ontleden pinnen, een horizontale snede te maken door de huid onmiddellijk aan de ventralekanaal zakken, ongeveer waar het voldoet aan het cochleair kanaal. Maak een verticale snede voorste en achterste naar de SAG. Gebruik een tang of een dissectie pin op te tillen en verwijder de klep van de huid begrensd door de drie bezuinigingen.

   Opmerking: De SAG is gelegen aan de rand van de anteroventral otocyst, ongeveer halverwege tussen de dorsale pouch die gemakkelijk zichtbaar met helderveld basis verlichting, en de ventrale cochleaire kanaal die ventromedially projecten en wordt verduisterd door de faryngeale bogen. Het cochleair kanaal verlengt zodat de dorsoventral dimensie stijgt geleidelijk op E4 tussen Hamburger-Hamilton stadia 23 tot 25 september.

4. Trek de otocyst in een posterieure richting om het te scheiden van de SAG. Verplaats weefsel rondom de SAG met de dissectie pinnen en voorzichtig de SAG te verwijderen uit het embryo met behulp van # 55 tang. Verwijder de grote stukken van mesenchymale weefsel en uitstekende zenuwbanen van de SAG.
5. Met behulp van een brede mond pipet tip, overdracht van de explantatie naar een24-wells plaat met 0,5 ml SAG explant holding medium. Houden explanten op ijs of op kamertemperatuur voor maximaal 4 uur.

3. Ruggenmerg dissectie

1. Verwijder de E6 embryo uit het ei en plaats deze in een schotel met kuiken Ringer-oplossing. Verwijder de kop en embryonale membranen.
2. Plaats het lichaam in een Sylgard © dissectie schotel met koud ruggenmerg dissectie medium. Positie en pin het embryo "ventrale down" en caudale tegenover de experimentator. Plaats ontleden pinnen door elk ledemaat en door het voorste einde.
3. Met behulp van een tang en / of ontleden van pennen, verwijder voorzichtig de huid en weefsel, het verplaatsen in een ventrale richting, tot aan de dorsale oppervlak van het ruggenmerg zichtbaar is.
4. Snijd de dorsale middellijn van het ruggenmerg met een dissectie pin, in een posterior naar anterior richting, langs de gehele lengte van het ruggenmerg. Dit leidt tot een "open boek" als de linker-en rechterkant van het ruggenmerg te scheiden.
5. Verwijder het ruggenmerg uit het lichaam door die het meest caudale uiteinde van het ruggenmerg met een tang en omhoog en weg van de experimentator. Verwijder de resterende DRG en hersenvliezen.
6. Houd een uiteinde van de het ruggenmerg met een pincet (of pin aan de schotel) en gebruik Vannas schaar te snijden langs de ventrale middellijn, aan het ruggenmerg halveren.
7. Houd een uiteinde van de explantatie met een tang om het weefsel te immobiliseren en gebruiken Vannas schaar om kleine explantaten (100-500 um in lengte) afgesneden langs de lengte van het weefsel. De vloerplaat kan worden herkend als een duidelijke verdikking van weefsel langs een explantatie rand.
8. Gebruik een brede mond pipet tip om explantaten over te dragen aan een 24 wells plaat met 0,5 ml koud dissectie medium. Houden explantaten op ijs te levensvatbaarheid van het weefsel, f onderhoudenof maximaal 4 uur.

4. Explantatie cultuur met gezuiverde eiwitten om neurieten reactiesnelheid te testen

1. Bereid een 1,5 mg / ml collageen oplossing in een 15 ml conische tube, op ijs, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Controleer de collageen-oplossing heeft een pH van 7-7,4 het gebruik van pH-indicator papier. Stel de pH door toevoeging van NaOH in een ul volumes.
3. Transfer explantaten een 24-wells plaat met behulp van een brede mond pipet tip en zuig overtollige vloeistof. Meerdere explanten kunnen worden gekweekt in een goed, maar moet worden geplaatst van ten minste 500 micrometer uit elkaar.
4. Voeg 0,5 ml van collageen aan het putje met de explantatie. Plaats de explantaat op de bodem van de put. Zorg ervoor dat elke cultuur volledig set voordat u verder gaat met de volgende goed, omdat de collageen zal beginnen te polymeriseren bij kamertemperatuur.
5. Plaats de petrischaal op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Wanneer het collageen is polymegoedkeuring gegeven voor het zal een gel lijken.
6. Voeg 0,5 ml warm explantatie kweekmedium aangevuld met ofwel gezuiverde eiwitten (verdund in PBS) of PBS (Control) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO _2. Effecten op neurietuitgroei zichtbaar moet zijn met 24 uur.

   LET OP: Wij hebben hetzelfde protocol om de cultuur SAG explantaten tot 42 uur.

5. Explantatie co-cultuur met eiwit-gecoate kralen om directionele neurietuitgroei-test

1. Begin met explant cultuur stappen 4.1 tot 4.4.
2. Met behulp van een pipet, transfer 1-5 kralen uit PBS naar de bron die de collageen oplossing en explantatie.
3. Gebruik een tang om kralen 50 tot 500 micrometer positie van de rand van de explantatie.
4. Plaats de plaat op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Het weefsel of kralen kunnen worden verplaatst als het collageen polymeriseert. Controleer de culturen en herpositioneren het weefsel en kralen tijdens de eerste 5 minuten.
5. Voeg 0,5 ml SAG media aan elke well en incubeer gedurende 24 uur.

6. Visualisatie van neurietuitgroei door immunohistochemie

1. Spoel culturen in PBS en vast gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde in PBS.
2. Laat de gels van de muren van de putten door het opsporen van rond de rand van de gels met het afgeronde einde van een teflon micro-spatel. Voer de immunostain met de gels in de putten. Spoel verschillende keren in PBS.
3. Incubeer in 0,5 ml blokkeren oplossing (10% kalfsserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazide in PBS) overnacht bij 4 ° C.
4. 'S nachts Incubeer in 0,5 ml primaire antilichaam (anti-β-tubuline antilichaam verdund 1:500 in het blokkeren oplossing) bij 4 ° C.
5. Spoel verschillende keren in PBS. 'S nachts Incubeer in 0,5 ml secundair antilichaam (Alexa fluor 488 geit anti-muis IgG _2b antilichaam verdund 1:500) bij 4 ° C. Vanaf deze stap voorwaarts, houd platen in donkere of wikkel in folie, vanwege de gevoeligheid van het lichtsecundaire antilichamen.
6. Spoel verschillende keren in PBS en bewaar bij 4 ° C in PBS voor maximaal een week.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd NT-3 en NT-3-gecoate kralen op E4 chick SAG explantaten. SAG neuron cellichamen en neurieten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een 10x objectief op een confocale microscoop. Na 24 uur in vitro, SAG explantaten weergegeven grotere neurietuitgroei in de aanwezigheid van 100 ng / ml gezuiverd humaan NT-3 toegevoegd aan het celkweekmedium (1B), in vergelijking met controles (1A). SAG neuronen werden samen gekweekt met kralen geweekte in100 ng / ml NT-3 aan te tonen dat een puntbron van NT-3 ter plaatse kan neurietuitgroei te bevorderen. Explantaten weergegeven langer en dichter neurietuitgroei aan de kant van deExplantatie geconfronteerd met de hiel in vergelijking met de andere kant (1D) en vergeleken met culturen met kralen gedrenkt in PBS (1C) te controleren. Schaalbalk = 200 micrometer.

Figuur 2. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd Wnt5a en Wnt5a gecoate kralen op E6 chick ruggenmerg. Ruggenmerg explantaten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een confocale microscoop. Na 24 uur van de groei in de aanwezigheid van gezuiverd muis Wnt5a (400ng/ml), neurietuitgroei van Chick ruggenmerg explantaten werd verhoogd (2B) in vergelijking met controles gekweekt zonder Wnt5a (2A). Kralen gedrenkt in 500 ng / ml Wnt5a, 300-500 urn geplaatst vanaf de rand van het ruggenmerg explantaten, ook bevorderd neurietuitgroei (2D) in vergelijking met culturen (2C) controle. Vergelijkbare co-cultuur resultaten werden eerder gepubliceerd met Wnt5a-expressie brengende cellen ^8. Schaalbalk = 200urn.

Discussion

Wij presenteren een methode te ontleden en cultuur E4 SAG en E6 ruggenmerg explantaten, van kuiken, onder serum-vrije omstandigheden. Deze procedure wordt momenteel gebruikt in ons lab aan de gevolgen van de verschillende afgescheiden liganden op SAG neuron overleving en neurietuitgroei studie. Nieuwe aspecten van dit protocol zijn het gebruik van een serum-vrij systeem voor het kweken van explantaten en het gebruik van kralen gedrenkt in groeifactoren de effecten op de SAG neurietuitgroei te bestuderen. Een kraal methode vergelijkbaar met die van ons is beschreven voor het kuiken ruggenmerg ^10. Traditioneel zijn kralen gebruikt in studies met klassieke axon begeleiding factoren en morphogens. Hier hebben we aangetoond dat de kraal test kan ook worden gebruikt om de effecten van neurotrofinen (of andere groeifactoren) op neurietuitgroei (afb. 1) te onderzoeken.

Er zijn kritische stappen in de procedure die moet mogelijk worden aangepast of geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen. Deze stappen zijn ook belangrijke variabelen voor trouble-shooting experimenten die lijken te zijn mislukt. De eerste, neurotrofine-3 (NT-3), ciliaire neurotrofe factor (CNTF) en ITS (insuline, transferrine, Selenium) werden toegevoegd aan het kweekmedium aan SAG neuron overleven bevorderen en neurietuitgroei ^6,8 te verbeteren. Deze groeifactoren zijn opgenomen in het ruggenmerg experimenten om de bioactiviteit van moleculen te testen onder dezelfde test voorwaarden die de SAG explantaten werden getest. Kunnen echter ook andere groeifactoren zijn meer geschikt voor deze en andere weefsels types. Ten tweede, was een 1,5 mg / ml concentratie van collageen gekozen na het testen van een reeks van collageen concentraties (0.5, 1.0, 1.5 en 2 mg / ml), omdat het geproduceerde meest robuuste neurietuitgroei uit de E4 kip SAG na 24u. Andere bronnen van neuronen geeft mogelijk een verschillende optimale van collageen. Ten slotte moet het eiwit concentraties, het aantal kralen, en de afstand tussen de explantaten en kralen ook worden geoptimaliseerd voor elke toepassing. Enige groei feitultraperifere regio's, zoals morphogens, worden uitgedrukt in verlopen en oefenen concentratie-afhankelijke effecten op de groei van axonen tijdens de ontwikkeling ^11. Daarom moet een reeks concentraties altijd worden getest met neurietuitgroei assays. Zorg moeten worden genomen om de toxiciteit te vermijden: we hebben waargenomen verhoogde niveaus van celdood met hoge concentraties van een aantal eiwitten (bijv. Sonic Hedgehog).

Deze methode kan worden aangepast voor extra toepassingen, waaronder andere leeftijden, weefseltypen, co-cultuur methoden, en extra immunokleuring (bijv. overleving van de cel assays). We hebben met succes gekweekt E3-E5 SAG, E6 netvlies, en E7 bulbus olfactorius explantaten, van kuiken, met dezelfde kweekomstandigheden. Wanneer uitgroei is robuust in controlemonsters, kan deze methode ook onthullen weerzinwekkend reacties op uitgescheiden factoren. Gelijkaardige methodes werden gebruikt voor het testen van effecten van morphogens op de zoogdieren neuronen ^12,13, en we zijn op dit moment onderzoek naar de effecten van de BMP's, FGF, en Shh op de SAG neurietuitgroei. Ook omdat het collageen gels worden gepolymeriseerd in een 24-well plaat, ze zijn groot genoeg voor de volgende inbedding en snijden met een cryostaat. We routinematig uitvoeren van TUNEL testen op vriescoupes van collageen gel culturen, die ons in staat stelt tot het niveau van celoverleving correleren met de hoeveelheid neurietuitgroei uit hetzelfde monster ^8.

Er zijn beperkingen voor het gebruik van het collageen gel assays op de manier waarop we hebben ze hier gepresenteerd. Kan bijvoorbeeld responsen waargenomen in de opzet vereenvoudigde in-vitro-omgeving niet overeen met de antwoorden op de dezelfde factor wanneer aanwezig in de meer complexe in vivo situatie. Ook, kunnen we niet perifere onderscheiden van centrale processen en kan niet auditieve onderscheiden van vestibulair neurieten. Daarom kan heterogeniteit in de respons tussen deze populaties opbrengst onregelmatig of niet-uniforme uitgroei of, indien de reagerende bevolking is een klein deel van detotaal zijn, kan het ganglion worden gescoord als tonen geen effect. Ten slotte hebben wij voorgesteld een methode die kan tot cultuur E4 SAG explanten worden gebruikt onder serum-vrije omstandigheden met aanzienlijke neuron te overleven, met een verscheidenheid aan toepassingen van het bestuderen van overleving van cellen te axon begeleiding. Het geheel genomen, dit systeem is gunstig, omdat het toelaat om te controleren effecten als gevolg van de toevoeging van gezuiverd factoren alleen of in combinaties zonder de verstorende variabelen van andere factoren en uitgescheiden axon begeleiding signalen die aanwezig kunnen zijn in de in vivo omgeving.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well