Disseksjon og kultur av Chick Statoacoustic ganglion og Spinal Cord explants i Collagen Gels for neurite utvekst Assays

Summary

Vi viser hvordan å dissekere og kultur chick E4 statoacoustic ganglion og E6 ryggmargen explants. Explants dyrkes i henhold til serum-frie forhold i 3D kollagen gels i 24 timer. Neurite respons er testet med vekstfaktor-supplert medium og med protein-belagt perler.

Abstract

Den sensoriske organer kylling indre øret er innerverte av perifere prosesser statoacoustic ganglion (SAG) nerveceller. Sensoriske organ innervasjon er avhengig av en kombinasjon av axon veiledning pekepinner ¹ og overlevelse faktorer ² ligger langs banen voksende axoner og / eller innenfor de sensoriske organ mål. For eksempel generert funksjonelle forstyrrelser med en klassisk axon veiledning signalveien, semaphorin-neuropilin, misrouting av otic axons ^3. Også flere vekstfaktorer uttrykt i sensoriske mål i det indre øret, inkludert Neurotrophin-3 (NT-3) og Brain Avledet neurotrophic Factor (BDNF), har blitt manipulert i transgene dyr, igjen fører til misrouting av SAG axons ^fire. De samme molekylene fremme både overlevelse og neurite utvekst av chick SAG nerveceller in vitro ^5,6.

Her beskriver vi og demonstrere in vitro metode er vi for tiden usynge for å teste responsen til chick SAG neurites til løselige proteiner, inkludert kjente morphogens som Wnts, samt vekstfaktorer som er viktige for å fremme SAG neurite utvekst og neuron overlevelse. Ved hjelp av denne modellen system, håper vi å trekke konklusjoner om effekter som utskilles ligander kan øve på SAG neuron overlevelse og neurite utvekst.

SAG explants er dissekert på embryonale dag 4 (E4) og kultivert i tredimensjonale kollagen gel henhold til serum-frie forhold i 24 timer. Først er neurite respons testet av dyrkning explants med protein-supplert medium. Så, for å spørre om punktkilder av utskilles ligander kan ha retningsbestemt effekter på neurite utvekst, er explants co-kultiverte med protein-belagt perler og analysert for evne til perle til lokalt fremme eller hemme utvekst. Vi inkluderer også en demonstrasjon av disseksjon (modifisert protokoll ⁷⁾ og kultur av E6 ryggmargen explants. Virutinemessig bruk ryggmargen explants å bekrefte bioaktivitet av proteiner og protein-gjennomvåt perler, og for å verifisere arter kryssreaksjon med kylling vev, under samme kultur vilkår som SAG explants. Disse in vitro er praktisk for raskt screening for molekyler som utøver trofisk (overlevelse) eller tropic (retningsbestemt) effekter på SAG nervecellene, spesielt før du utfører studier in vivo. Videre tillater denne metoden testing av enkelte molekyler i henhold til serum-frie forhold, med høy neuron overlevelse ^8.

Protocol

Oppskrifter

Chick ringers

7,2 g	NaCl
0,23 g	CaCl 2 + 2H 2 O
0,37 g	KCl
0,115 g	Na 2 HPO 4
900 ml	Vann (Tissue kultur grade)

Merk: Juster pH til 7,4. Ta endelig volum til 1000 ml med vann.

10X PBS

40 g	NaCl
1 g	KCl
7 g	Na 2 HPO 4
1,2 g	KH 2 PO 4
450 ml	DEPC vann

Merk: Juster pH til 7,4. Ta endeligvolum til 500 ml med vann. Working konsentrasjonen (1X) er laget ved å fortynne en del 10X bestanden med 9 deler av vev-kultur grade vann, slik som den som oppnås med en Millipore UV bestråling system for å generere vann med 18 MΩ-cm ledningsevne.

SAG eksplantering holde medium

• DMEM/F12 med L-glutamin, 10 mM Hepes
• 10% Insulin, Overføre, Selen (ITS +1)
• 1% penn-Strep

Eksplantering kultur medium

• SAG eksplantering holde medium
• 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3)
• 10 ng / ml ciliary neurotrophic factor (CNTF)

Ryggmargen disseksjon og holde medium

• L-15
• 10% kalvefoster serum
• 1% penn-Strep

Inkuber egg ved 37-38 ° C. Steriliser dissecting verktøy og Sylgard dissecting parabol i 70% etanol. Dissecting retter og verktøy kan også være UV sterilisert natten.

1. Plasser perler i en microtube med 1 ml steril PBS, bland, og vent til perler å bosette seg til bunnen av røret.
2. Vask perlene flere ganger ved å fjerne supernatanten etter perlene har slått seg ned og resuspender i PBS.
3. Inkuber perler i renset protein (fortynnet i PBS) eller PBS alene (Control) for 1 time ved romtemperatur.
4. Skyll perler i PBS og oppbevar i en 24-brønns plate med 1 ml PBS inntil plassert i kollagen.

2. Statoacoustic ganglion disseksjon

1. På E4 fjerne fosteret fra egg og legg den i en rett med kylling Ringer løsning for å fjerne embryonale membraner.
2. Plasser embryo i en Sylgard © foret petriskål fylt med kaldt HBSS og posisjon embryoet på sin side med otic vesicle vendt opp. Pin embryoet til rett bruker dissecting pins.
3. Bruk to dissecting pins, lage en horisontal skjære gjennom huden straks ventral tilcanal poser, omtrent der den møter cochlear duct. Gjør et vertikalt kutt anterior og posterior til SAG. Bruk pinsett eller en dissecting pin til å løfte og ta klaffen av huden grenser til de tre kutt.

   Merk: SAG ligger i anteroventral kanten av otocyst, omtrent midtveis mellom dorsal posen som er lett synlig med lysfelt basen belysning, og den ventrale cochlear duct hvilke prosjekter ventromedially og er skjult av svelg buer. Den sneglehuset duct elongates så det dorsoventral dimensjonen vil gradvis øke på E4 mellom Hamburger-Hamilton stadier 23 til 25 september.

4. Trekk otocyst i en posterior retning for å skille den fra SAG. Fortrenge vevet rundt SAG med disseksjon pins og fjern forsiktig SAG fra embryo ved hjelp av # 55 tang. Fjerne store biter av mesenkymale vev og utstående nerve bunter fra SAG.
5. Ved hjelp av en bred munn pipette spissen, overføre eksplantering til en24-bra plate med 0,5 ml SAG eksplantering holder medium. Hold explants på is eller i romtemperatur i opptil 4 timer.

3. Ryggmargen disseksjon

1. Fjern E6 embryo fra egg og legg den i en skål med kylling Ringer-løsning. Fjern hodet og embryonale membraner.
2. Plasser kroppen i en Sylgard © dissecting parabolen inneholder kald ryggmargen disseksjon medium. Posisjon og pin embryoet "ventral down" og kaudale mot eksperimentator. Plasser dissecting pins gjennom hver ekstremitet og gjennom den fremre enden.
3. Bruk pinsett og / eller dissekere pins, nøye fjerne hud og vev, beveger seg i en ventral retning, inntil dorsal overflaten av ryggmargen er synlig.
4. Kutt dorsal midtlinjen av ryggmargen med en dissekere pin, i en posterior til anterior retning, langs hele lengden av ryggmargen. Dette skaper en "åpen bok" som venstre og høyre side av ryggmargen separate.
5. Fjern ryggmargen fra kroppen ved å holde caudal-mest enden av ryggmargen med pinsett og løfte opp og bort fra eksperimentator. Fjern gjenværende DRG og hjernehinnene.
6. Hold den ene enden av ryggmargen med pinsett (eller pin den til parabolen) og bruk Vännäs saks for å klippe langs ventrale midtlinjen, for å halvere ryggmargen.
7. Hold den ene enden av eksplantering med pinsett til immobilize vevet og bruk Vännäs saks til å klippe små explants (100-500 um i lengde) langs lengden av vevet. Gulvet plate kan bli anerkjent som en tydelig fortykkelse av vev langs den ene eksplantering kant.
8. Bruk en bred munn pipettér spissen å overføre explants til en 24 godt plate med 0,5 ml kaldt disseksjon medium. Hold explants på isen for å opprettholde vev levedyktighet, feller opptil 4 timer.

Fire. Eksplantering kultur med renset proteiner for å teste neurite reaksjonsevne

1. Utarbeide en 1,5 mg / ml kollagen løsning i en 15 ml konisk tube, på is, i henhold til produsentens anvisninger.
2. Kontroller at kollagen løsningen har en pH på 7 til 7,4 bruke pH-indikator papir. Juster pH ved å tilsette NaOH i 1 mL volumer.
3. Transfer explants til en 24-brønn plate med et bredt munn pipettér tip og aspirer overflødig væske. Flere explants kan dyrkes i en brønn, men bør plasseres minst 500 mikrometer fra hverandre.
4. Tilsett 0,5 ml av kollagen til brønnen inneholder eksplantering. Plasser eksplantering på bunnen av brønnen. Pass på å sette hver kultur helt før du fortsetter med neste brønn fordi kollagen vil begynne å polymerisere ved romtemperatur.
5. Plasser kultur plate på et 37 ° C skyv varmere i 30-45 min til Polymeriserer kollagen. Når kollagen har polymerized det vil ligne en gel.
6. Tilsett 0,5 ml varm eksplantering kultur medium supplert med enten renset proteiner (fortynnet i PBS) eller PBS (Control) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO _2. Effekter på neurite utvekst skal være synlig med 24 timer.

   MERK: Vi har brukt den samme protokollen til kultur SAG explants opp til 42 timer.

5. Eksplantering co-kulturen med protein-belagt perler å teste retningsbestemt neurite utvekst

1. Begynn med eksplantering kultur skritt 04.01 til 04.04.
2. Ved hjelp av en pipette, transfer 1-5 perler fra PBS til brønnen inneholder kollagen løsning og eksplantering.
3. Bruk pinsett til å posisjonere perler 50-500 mikrometer fra kanten av eksplantering.
4. Sett platen på et 37 ° C skyv varmere i 30-45 min til Polymeriserer kollagen. Vevet eller perle kan bli fordrevet som kollagen polymerizes. Sjekk kulturer og re-posisjonere vev og perler i løpet av de første 5 min.
5. Tilsett 0,5 ml SAG media til hver brønn og inkuberes i 24 timer.

Seks. Visualisering av neurite utvekst ved immunhistokjemi

1. Skyll kulturer i PBS og fikse i 1 time ved romtemperatur i 4% Paraformaldehyde i PBS.
2. Slipp gels fra veggene av brønnene ved tracing rundt kanten av gels med den runde enden av en teflon mikro slikkepott. Utfør immunostain med gels i brønnene. Skyll flere ganger i PBS.
3. Inkuber i 0,5 ml blokkering løsning (10% kalv serum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazid i PBS) over natten ved 4 ° C.
4. Inkuber i 0,5 ml primære antistoff (anti-β-tubulin antistoff fortynnes 1:500 i blokkering løsning) over natten ved 4 ° C.
5. Skyll flere ganger i PBS. Inkuber i 0,5 ml sekundært antistoff (Alexa fluor 488 geit anti-mus IgG _2b antistoff fortynnes 1:500) over natten ved 4 ° C. Fra dette skritt fremover, holde platene i mørke eller pakk inn i folie, på grunn av lysfølsomhet påsekundære antistoffer.
6. Skyll flere ganger i PBS og oppbevar ved 4 ° C i PBS i opptil en uke.

7. Representant Resultater

Figur 1. Representant resultatene av neurite-fremme effekter av renset NT-3 og NT-3-belagt perler på E4 chick SAG explants. SAG neuron celle organer og neurites var immunostained med β-tubulin og avbildes med et 10x objektiv på en confocal mikroskop. Etter 24 timer in vitro, viste SAG explants større neurite utvekst i nærvær av 100 ng / ml renset human NT-3 lagt til cellekultur medium (1B), sammenlignet med kontroller (1A). SAG nevroner var co-kultiverte med perler gjennomvåt in100 ng / ml NT-3 for å demonstrere at et punkt kilde til NT-3 kan lokalt fremme neurite utvekst. Explants vises lengre og tettere neurite utvekst på siden aveksplantering mot perle i forhold til motsatt side (1D) og sammenlignet med kontrollgruppen kulturer med perler dyppet i PBS (1C). Scale bar = 200 mikrometer.

Figur 2. Representant resultatene av neurite-fremme effekter av renset Wnt5a og Wnt5a-belagt perler på E6 chick ryggmargen. Ryggmargen explants var immunostained med β-tubulin og avbildes med en confocal mikroskop. Etter 24 timer med vekst i nærvær av renset mus Wnt5a (400ng/ml), neurite utvekst fra chick ryggmargen explants ble økt (2B) sammenlignet med kontroller dyrkede uten Wnt5a (2A). Perler dynket i 500 ng / ml Wnt5a, plassert 300-500 mikrometer fra kanten av ryggmargen explants, også fremmet neurite utvekst (2D) sammenlignet med kontrollgruppen kulturer (2C). Lignende co-kulturen resultater ble tidligere utgitt med Wnt5a-uttrykke celler ^8. Scale bar = 200mikrometer.

Discussion

Vi presenterer en metode for å dissekere og kultur E4 SAG og E6 ryggmargen explants, fra kylling, under serum-free forhold. Denne prosedyren brukes i dag i vårt laboratorium for å studere effekter av ulike utskilles ligander på SAG neuron overlevelse og neurite utvekst. Novel aspekter av denne protokollen inkluderer bruk av et serum-free system for dyrking explants og bruk av perler dynket i vekstfaktorer for å studere effekter på SAG neurite utvekst. En perle metode som oss har blitt beskrevet for dama ryggmargen ^10. Tradisjonelt har perler blitt brukt i studier med klassisk axon veiledning faktorer og morphogens. Her har vi vist at perlen analysen kan også brukes til å undersøke effektene av neurotrophins (eller andre vekstfaktorer) på neurite utvekst (Fig. 1).

Det er kritiske trinn i prosedyren som må endres eller optimalisert for ulike bruksområder. Disse trinnene er også viktige variabler for trouble-skyting eksperimenter som synes å være mislykket. Først Neurotrophin-3 (NT-3), ciliary neurotrophic factor (CNTF) og ITS (Insulin, Transferrin, selen) ble lagt til kultur medium for å fremme SAG nevron overlevelse og forbedre neurite utvekst ^6,8. Disse vekstfaktorer er inkludert i ryggmargen eksperimenter for å teste bioaktivitet av molekyler under samme analysen vilkår at SAG explants ble testet. Imidlertid kan andre vekstfaktorer være mer passende for disse og andre typer vev. Sekund, var en 1,5 mg / ml konsentrasjon av kollagen valgt etter å ha testet et utvalg av kollagen konsentrasjoner (0.5, 1.0, 1.5 og 2 mg / ml) fordi det produseres mest robuste neurite utvekst fra E4 kylling SAG etter 24 timer. Andre kilder av nerveceller kan vise et annet optimal av kollagen. Til slutt bør protein konsentrasjoner, antall perler, og avstanden mellom explants og perler også være optimalisert for hver applikasjon. Noen vekst faktumORS, som morphogens, er uttrykt i gradienter og utøve konsentrasjon-avhengige effekter på vekst axons under utvikling ^11. Derfor bør en rekke konsentrasjoner alltid testes med neurite utvekst analyser. Forsiktighet bør utvises for å unngå toksisitet: vi har observert forhøyede nivåer av celledød med høye konsentrasjoner av enkelte proteiner (f.eks, Sonic pinnsvin).

Denne metoden kan tilpasses for ekstra programmer, inkludert andre aldre, vevstyper, co-kultur metoder, og ytterligere farging (f.eks, celle overlevelse-analyser). Vi har lykkes dyrket E3-E5 SAG, E6 netthinnen, og E7 luktelappen explants, fra kylling, bruker den samme kulturen vilkår. Når utvekst er robust i kontrollprøvene, kan denne metoden også avsløre frastøtende svar på secreted faktorer. Liknende metoder ble brukt for å teste effekten av morphogens på pattedyr nevroner ^12,13, og vi undersøker effekten av fil fra BMP, FGFs, og Sht på SAG neurite utvekst. Også, siden kollagen gels er polymerisert i en 24-brønns plate, de er store nok for etterfølgende innstøping og snitting med en cryostat. Vi rutinemessig utfører Tunel analyser på cryosections av kollagen gel kulturer, noe som gjør oss i stand til å korrelere graden av celle overlevelse med mengden neurite utvekst fra samme prøve ^8.

Det er begrensninger med kollagen gel assays på den måten at vi har presentert dem her. For eksempel kan responser observert i de bevisst forenklede in vitro miljø ikke nødvendigvis svar på samme faktor når til stede i mer komplekse in vivo situasjon. I tillegg kan vi ikke skille perifere fra sentrale prosesser og kan ikke skille auditiv fra vestibulære neurites. Derfor kan heterogenitet i respons blant disse populasjonene yield uregelmessig eller ikke-uniform utvekst eller, hvis svare befolkningen er en liten brøkdel avTotalt kan ganglion scores som viser ingen effekt. Endelig har vi presentert en metode som kan brukes til kultur E4 SAG explants henhold til serum-free tilstander med betydelige nervecellen overlevelse, med en rekke programmer fra å studere celle overlevelse til axon veiledning. Totalt sett er dette systemet gunstig fordi det gjør det mulig å overvåke effekter på grunn av tillegg av renset faktorer alene eller i kombinasjoner uten konfunderende variabler av andre skilles faktorer og axon veiledning pekepinner som kan være til stede i in vivo miljøet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope			We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer	C.S. E.		Collagen polymerization
Chicken egg incubator
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator
Sylgard© coated petri dish
24-well cell culture plate	Corning	3526
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55 Dumont forceps	Fine Science Tools	11295-51
Stainless steel dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10	Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon	Fine Science Tools	10370-17	Embryo harvest/transfer
200 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	118-96R	Explant transfer
E4 and E6 chicken eggs
Chick Ringer’s solution			Embryo harvest
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	SAG dissection
L15 medium	Sigma-Aldrich	L5520	Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11150	Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors	World Precision Instruments, Inc.	501778	Spinal cord dissection
Rat-tail collagen Type I	BD Biosciences	354249	Explant culture
10X PBS (Sterile)			To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)			To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)			To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)	Whatman, GE Healthcare	2629-990	To check collagen pH
15 ml conical tubes	Dot Scientific, Inc.	818-PG
500 μl wide mouth pipet tips	Dot Scientific, Inc.	119-R100	To pipet collagen
DMEM/F12 medium	Sigma-Aldrich	D8437	Explant culture medium
ITS+1	Sigma-Aldrich	I2521	Medium supplement
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Medium supplement
CNTF (rat)	Sigma-Aldrich	C3835	Medium supplement
NT-3 (human)	Sigma-Aldrich	N1905	Medium supplement
Purified mouse Wnt5a	R&D Systems	645-WN-010
Affi-gel Blue gel beads	Bio-Rad	153-7302
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation
PBS			Rinses
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Blocking solution
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Blocking solution
Calf serum	Invitrogen	16170-078	Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody	Sigma-Aldrich	T8535	Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody	Invitrogen	A21141	Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula	VWR international	57949-033	Release collagen gels from well