Summary
Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.
Abstract
Les organes sensoriels de l'oreille interne de poulet sont innervés par le processus périphériques du ganglion statoacoustic (SAG) des neurones. Innervation organe sensoriel repose sur une combinaison de signaux de guidage axonal 1 et 2 facteurs de survie situé le long de la trajectoire des axones en croissance et / ou au sein de leurs objectifs organe sensoriel. Par exemple, les interférences fonctionnelles avec une voie de guidage des axones classiques de signalisation, sémaphorine-neuropiline, a généré l'erreur d'acheminement des axones otique 3. En outre, plusieurs facteurs de croissance exprimés dans les objectifs sensorielles de l'oreille interne, y compris la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), ont été manipulées dans des animaux transgéniques, conduisant de nouveau à l'erreur d'acheminement de 4 axones SAG. Ces mêmes molécules promouvoir à la fois la survie et la croissance des neurites de neurones in vitro de la SAG chiches 5,6.
Ici, nous décrire et démontrer la méthode in vitro nous sommes actuellement uchantent pour tester la réactivité des neurites SAG chiches aux protéines solubles, y compris morphogènes connus tels que les Wnts, ainsi que les facteurs de croissance qui sont importants pour la promotion de la croissance des neurites SAG et la survie des neurones. L'utilisation de ce système modèle, nous espérons pouvoir tirer des conclusions sur les effets que les ligands sécrétés peuvent exercer sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites.
Explants SAG sont disséqués au jour embryonnaire 4 (E4) et cultivées dans des gels de collagène en trois dimensions dans un milieu sans sérum pendant 24 heures. Tout d'abord, la réactivité des neurites est testé par des explants de culture avec des protéines complétés moyenne. Puis, de se demander si les sources ponctuelles de ligands sécrétés peuvent avoir des effets directionnels sur l'excroissance des neurites, les explants sont co-cultivées avec des billes recouvertes de protéines et analysés pour la capacité de la perle localement promouvoir ou inhiber le développement. Nous incluons également une démonstration de la dissection (modifié le protocole 7) et la culture des explants E6 moelle épinière. Nousutilisent couramment des explants de moelle épinière pour confirmer la bioactivité des protéines et protéines-trempés perles, et de vérifier les espèces réactivité croisée avec des tissus de poussins, dans les conditions même culture que les explants SAG. Ces tests in vitro sont pratique pour rapidement criblage de molécules qui exercent trophiques (survie) ou Tropic (directionnelle) effets sur les neurones du SAG, surtout avant d'effectuer des études in vivo. Par ailleurs, cette méthode permet de tester des molécules individuelles dans un milieu sans sérum, avec des neurones de survie élevé 8.
Protocol
Recettes
Ringers Chick
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Eau (grade de culture de tissus) |
Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez un volume final de 1000 ml avec de l'eau.
PBS 10X
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4 |
| 1,2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ml | Eau DEPC |
Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez finalesvolume à 500 ml avec de l'eau. La concentration de travail (1X) est obtenue en diluant une partie des stocks 10X à 9 parties d'eau de qualité culture tissulaire, telle que celle obtenue avec un système d'irradiation UV Millipore pour générer de l'eau avec 18 MQ cm conductivité.
SAG moyennes explant tenant
- DMEM/F12 avec L-glutamine, 10 mM Hepes
- L'insuline de 10%, Transfert, Sélénium (STI 1)
- 1% stylo-strep
Milieu de culture des explants
- SAG moyennes explant tenant
- 10 ng / ml neurotrophine-3 (NT-3)
- 10 ng / ml de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF)
Dissection de la moelle épinière et moyennes tenant
- L-15
- 10% sérum de veau foetal
- 1% stylo-strep
Incuber les œufs à 37-38 ° C. Stériliser les outils et les disséquer plat Sylgard dissection de l'éthanol à 70%. Disséquer la vaisselle et les outils peuvent également être stérilisée aux UV pendant la nuit.
- Placez des perles dans un microtube avec 1 ml de PBS stérile, mélanger et attendre que les perles de s'installer au fond du tube.
- Laver les billes plusieurs fois en enlevant le surnageant après les perles se sont installés et remettre en suspension dans du PBS.
- Incuber les billes en protéine purifiée (dilué dans du PBS) ou du PBS seul (contrôle) pendant 1 heure à température ambiante.
- Rincez les perles dans du PBS et de stocker dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS avant d'être placée dans le collagène.
2. La dissection ganglionnaire Statoacoustic
- Sur E4 retirer l'embryon de l'oeuf et le placer dans un plat avec une solution de Ringer chiches pour enlever les membranes embryonnaires humaines.
- Placez l'embryon dans un plat Sylgard © bordée de Pétri remplie de HBSS froid et la position de l'embryon sur le côté avec la vésicule otique vers le haut. Pin de l'embryon à l'antenne utilisant des goupilles de dissection.
- En utilisant deux broches de dissection, faire une coupe horizontale à travers la peau immédiatement à l'ventralesachets canal, à peu près où il rencontre le conduit cochléaire. Faire une coupe verticale antérieure et postérieure à la SAG. Utilisez une pince ou une épingle à dissection pour soulever et retirer le lambeau de peau bordée par les trois coupes.
Remarque: Le SAG est situé au bord de l'antéroventral otocyste, à mi-chemin entre la poche dorsale, qui est facilement visible avec un éclairage de base clair, et le conduit cochléaire ventrale qui projette ventromedially et est obscurci par les arcs branchiaux. Le s'allonge cochléaire conduit donc sa dimension dorsoventral augmentera progressivement sur E4 entre Hamburger-Hamilton phases 23 à 25 septembre.
- Tirez le otocyste dans une direction postérieure à le séparer de la SAG. Déplacer les tissus environnants le SAG avec des épingles de dissection et retirer délicatement le SAG de l'embryon en utilisant # 55 forceps. Retirer de grands morceaux de tissu mésenchymateux et de faisceaux de nerfs sortant de la SAG.
- En utilisant une pointe à large embouchure pipette, transférer l'explant à un24 puits, la plaque avec 0,5 ml explant SAG la tenue moyenne. Gardez explants sur la glace ou à température ambiante pendant 4 heures.
3. Dissection de la moelle épinière
- Retirez l'embryon E6 de l'œuf et le placer dans un plat contenant une solution de Ringer chiches. Retirer la tête et les membranes embryonnaires humaines.
- Placer le corps dans un plat de Sylgard © dissection froide contenant moyenne vertébrale de dissection du cordon. Position et la broche de l'embryon "bas ventre" et caudale face à l'expérimentateur. Placez broches dissection travers chaque membre et par l'extrémité antérieure.
- En utilisant des pinces et / ou dissection broches, retirez délicatement la peau et des tissus, se déplaçant dans une direction ventrale, jusqu'à ce que la surface dorsale de la moelle épinière est visible.
- Couper la ligne médiane dorsale de la moelle épinière avec une épingle de dissection, dans un postérieur à la direction antérieure, sur toute la longueur de la moelle épinière. Cela crée un «livre ouvert», comme les côtés gauche et droit de la moelle épinière séparée.
- Retirer la moelle épinière du corps en tenant l'extrémité caudale le plus de la moelle épinière avec une pince de levage et de haut et loin de l'expérimentateur. Retirer DRG restantes et les méninges.
- Tenir une extrémité de la corde spinale l'aide d'une pince (ou la broche à l'antenne) et utiliser des ciseaux pour couper le long Vannas la ligne médiane ventrale, pour bissectrice la moelle épinière.
- Tenir une extrémité de l'explant avec des pinces pour immobiliser le tissu et utiliser des ciseaux pour couper Vannas explants petite (100-500 um de longueur) sur toute la longueur du tissu. La plaque de sol peut être reconnu comme un épaississement des tissus clairs long d'un bord explant.
- Utiliser une pipette à large embouchure de transfert des explants sur une plaque de 24 puits avec 0,5 ml de dissection moyennes froid. Gardez explants sur la glace pour maintenir la viabilité des tissus, fou jusqu'à 4 heures.
4. Explantation de la culture avec des protéines purifiées afin de tester la réactivité des neurites
- Préparer une solution de collagène 1,5 mg / ml dans un tube de 15 ml conique, sur la glace, selon les instructions du fabricant.
- Vérifier la solution de collagène a un pH de 7 à 7,4 sur le papier indicateur de pH à l'aide. Ajuster le pH en ajoutant du NaOH en volumes de 1 pl.
- Transfert des explants à une plaque de 24 puits en utilisant une pointe large bouche pipette et aspirer le liquide en excès. Explants multiples peuvent être cultivées dans un puits, mais doit être placé à au moins 500 um uns des autres.
- Ajouter 0,5 ml de collagène pour le puits contenant l'explant. Position de l'explant sur la surface du fond du puits. Veillez à régler chaque culture complètement avant de procéder à la même suivant car le collagène commence à polymériser à température ambiante.
- Placer la plaque de culture sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Lorsque le collagène a polymerized qu'il ressemble à un gel.
- Ajouter 0,5 ml de milieu de culture chaleureuse explant soit complétée par des protéines purifiées (dilué dans du PBS) ou de PBS (contrôle) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Effets sur la croissance des neurites doit être visible par les 24 heures.
NOTE: Nous avons utilisé le même protocole pour la culture des explants SAG jusqu'à 42 heures.
5. Explantation de co-culture avec des billes recouvertes de protéines pour tester neurites directionnels
- Commencez avec des étapes de la culture des explants 04/01 au 04/04.
- Aide d'une pipette, transférer les billes de 1-5 PBS pour le puits contenant la solution de collagène et d'explantation.
- Utilisez une pince à la position des billes de 50 à 500 um à partir du bord de l'explant.
- Placer la plaque sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Le tissu ou une bille peut devenir déplacées comme le collagène se polymérise. Vérifiez les cultures et les re-positionner le tissu et perles au cours des 5 premières minutes.
- Ajouter 0,5 mL SAG médias à chaque puits et incuber pendant 24 heures.
6. Visualisation des neurites par immunohistochimie
- Rincez les cultures dans le PBS et fixer pendant 1 heure à température ambiante dans du paraformaldéhyde 4% dans le PBS.
- Communiqué de gels sur les murs des puits en traçant autour du bord des gels avec l'extrémité arrondie d'une spatule en téflon micro. Effectuez la immunocoloration avec les gels dans les puits. Rincez plusieurs fois dans du PBS.
- Incuber dans 0,5 ml de solution de blocage (10% de sérum de veau, 0,1% de Triton X-100, l'azoture de sodium à 0,1% dans PBS) pendant la nuit à 4 ° C.
- Incuber dans 0,5 ml d'anticorps primaire (anticorps anti-β-tubuline anticorps dilué 1:500 dans une solution de blocage) nuit à 4 ° C.
- Rincez plusieurs fois dans du PBS. Incuber dans 0,5 ml d'anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris 2b anticorps dilué 1:500) nuit à 4 ° C. De ce pas en avant, garder les plaques dans l'obscurité ou envelopper dans du papier, en raison de sensibilité à la lumière desAnticorps secondaires.
- Rincez plusieurs fois dans du PBS et conserver à 4 ° C dans du PBS pendant une semaine au maximum.
7. Les résultats représentatifs
Figure 1. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion des purifiée NT-3 et NT-3-billes recouvertes sur des explants E4 SAG poussin. SAG corps cellulaires des neurones et les neurites étaient immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un objectif 10x sur un microscope confocal. Après 24 heures in vitro, d'explants SAG affiché excroissance des neurites plus grande en présence de 100 ng / ml humaine purifiée NT-3 ajoutés au milieu de culture cellulaire (1B), comparé aux contrôles (1A). Neurones SAG ont été co-cultivées avec des perles trempés dans 100 ng / ml de NT-3 à démontrer que d'une source ponctuelle de NT-3 peut localement favoriser la croissance des neurites. Les explants affiché plus longtemps et plus dense excroissance des neurites sur le côté de laexplant face du talon par rapport au côté opposé (1D) et par rapport aux cultures témoins avec des perles trempée dans du PBS (1C). Barre d'échelle = 200 pm.
Figure 2. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion de la purifier et la Wnt5a Wnt5a enduit de perles sur cordon E6 chiches épinière. Explants de la moelle épinière ont été immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un microscope confocal. Après 24 heures de croissance, en présence de la souris purifiée Wnt5a (400ng/ml), la croissance des neurites à partir d'explants de poussins de la moelle épinière a été augmenté (2B) par rapport aux témoins cultivés sans Wnt5a (2A). Perles trempée dans 500 ng / ml Wnt5a, placé 300-500 um à partir du bord des explants de la moelle épinière, a également favorisé la croissance des neurites (2D) par rapport aux cultures témoins (2C). Similaires de co-culture des résultats ont déjà été publiés avec des cellules exprimant Wnt5a 8. Barre d'échelle = 200um.
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Discussion
Nous présentons une méthode de disséquer et de la culture E4 SAG et E6 explants de la moelle épinière, de poussins, sous des conditions sans sérum. Cette procédure est actuellement utilisée dans notre laboratoire pour étudier les effets des différents ligands sécrétés sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. De nouveaux aspects de ce protocole comprennent l'utilisation d'un système sans sérum pour les explants en culture et l'utilisation de billes trempées dans les facteurs de croissance pour étudier les effets sur la croissance des neurites SAG. Une méthode similaire à la nôtre billes a été décrite pour la nana de la moelle épinière 10. Traditionnellement, les perles ont été utilisées dans les études classiques avec des facteurs de guidage des axones et des morphogènes. Ici, nous avons montré que le dosage de billes peut aussi être utilisé pour étudier les effets des neurotrophines (ou autres facteurs de croissance) sur l'excroissance des neurites (Fig. 1).
Il ya des étapes critiques dans la procédure qui peut avoir besoin d'être modifié ou optimisés pour différentes applications. Ces étapes sont également des variables importantes pour TROUBle-tir des expériences qui semblent être infructueuse. Premièrement, la neurotrophine-3 (NT-3), le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et STI (insuline, la transferrine, sélénium) ont été ajoutés au milieu de culture pour favoriser la survie des neurones du SAG et améliorer la croissance des neurites 6,8. Ces facteurs de croissance sont inclus dans les expériences de la moelle épinière afin de tester la bioactivité des molécules dans les conditions même dosage que le SAG explants ont été testés. Toutefois, d'autres facteurs de croissance pourrait être plus approprié pour ces types de tissus et d'autres. Deuxièmement, un 1,5 mg / ml de concentration de collagène a été choisi après des essais une gamme de concentrations de collagène (0,5, 1,0, 1,5 et 2 mg / ml), car elle produit la croissance des neurites plus robuste de la SAG de poulet E4 après 24h. Autres sources de neurones peut afficher un optimum différent de collagène. Enfin, les concentrations en protéines, le nombre de billes, et la distance entre les explants et des perles devraient également être optimisés pour chaque application. Certains faits de croissanceSRO, comme morphogènes, sont exprimés en gradients et exercent des effets dépendant de la concentration sur les axones en croissance au cours du développement 11. Par conséquent, une gamme de concentrations doivent toujours être testés avec des dosages neurites. Des précautions doivent être prises pour éviter la toxicité: nous avons observé des niveaux élevés de la mort cellulaire à forte concentration de certaines protéines (par exemple, Sonic hedgehog).
Cette méthode peut être adaptée pour des applications supplémentaires, y compris d'autres âges, les types de tissus, de co-culture des méthodes et immunomarquage supplémentaires (par exemple, des tests de survie cellulaire). Nous avons réussi cultivés E3-E5 SAG, E6 rétine, et E7 explants bulbe olfactif, de poussins, en utilisant les mêmes conditions de culture. Lorsque excroissance est robuste dans les échantillons de contrôle, cette méthode peut aussi révéler des réponses aux facteurs sécrétés répulsive. Des méthodes semblables ont été utilisés pour tester les effets des morphogènes sur les neurones de mammifères 12,13, et nous étudions actuellement les effets des PGB, FGF, et Shh sur les neurites SAG. En outre, puisque les gels de collagène sont polymérisées dans une plaque de 24 puits, ils sont assez grands pour subséquentes enrobage et de sectionnement avec un cryostat. Nous faisons régulièrement effectuer des tests TUNEL sur cryocoupes des cultures gel de collagène, ce qui nous permet de corréler le niveau de la survie des cellules avec le montant de neurites à partir du même échantillon 8.
Il ya des limites à l'utilisation des dosages gel de collagène dans la façon dont nous les avons présentés ici. Par exemple, les réponses observées dans les délibérément simplifié environnement in vitro peuvent ne pas refléter les réponses à un même facteur quand il est présent dans la plus complexe la situation in vivo. De même, nous ne pouvons pas distinguer périphériques de processus centraux et ne peut pas distinguer à partir auditive neurites vestibulaire. Par conséquent, l'hétérogénéité de la réactivité de ces populations pourrait donner excroissance irrégulière ou non uniforme ou, si la population répond représente une petite fraction de latotal, le ganglion peut être marqué comme ne montrant aucun effet. Enfin, nous avons présenté une méthode qui peut être utilisé pour la culture des explants SAG E4 sous des conditions sans sérum avec la survie des neurones significatif, avec une variété d'applications de l'étude de la survie des cellules de guidage axonal. Globalement, ce système est bénéfique car elle permet de surveiller les effets dus à l'ajout de facteurs purifiés, seul ou en combinaisons sans les variables de confusion d'autres facteurs sécrétés et des signaux de guidage axonal qui peuvent être présents dans l'environnement in vivo.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de la Subvention RO1DC002756 Purdue Research Foundation. Nous tenons à remercier Doris Chang Wu et Wiese pour des conseils avec des expériences et McPhail Rodney à l'aide de chiffres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | ||
| Slide warmer | C.S. E. | Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator | |||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator | |||
| Sylgard© coated petri dish | |||
| 24-well cell culture plate | Corning | 3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 118-96R | Explant transfer |
| E4 and E6 chicken eggs | |||
| Chick Ringer’s solution | Embryo harvest | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma-Aldrich | L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | Spinal cord dissection |
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences | 354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| 1N NaOH (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| Distilled water (Sterile) | To neutralize collagen | ||
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman, GE Healthcare | 2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific, Inc. | 818-PG | |
| 500 μl wide mouth pipet tips | Dot Scientific, Inc. | 119-R100 | To pipet collagen |
| DMEM/F12 medium | Sigma-Aldrich | D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma-Aldrich | I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma-Aldrich | C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma-Aldrich | N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation |
| PBS | Rinses | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma-Aldrich | T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti -–mouse IgG2b antibody | Invitrogen | A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR international | 57949-033 | Release collagen gels from well |
References
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