Summary
יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.
Abstract
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מתעוררים כמקור חלופה אטרקטיבית עבור טיפול חלופי תא שכן ניתן להרחיב בתרבות הבדיל ללא הגבלת זמן לכל סוגי התאים בגוף. סוגים שונים של biomaterials יש גם שימש בתרביות תאים גזע לספק microenvironment מחקה נישה תא גזע 1-3. זו האחרונה היא חשובה לקידום התא אל התא אינטראקציה, התפשטות תאים, והתמיינות אל שושלות ספציפיות, כמו גם הארגון רקמה על ידי מתן תלת ממדי (3D) סביבת 4 כגון אנקפסולציה. עקרון אנקפסולציה התא כולל המלכוד של תאים חיים בגבולות קרום חדיר למחצה בתרבויות 3D 2. קרומים אלה מאפשרים לחילופי חמצן, חומרי מזון גירויים על פני הממברנות, ואילו הנוגדנים ותאי החיסון של המארח שגודלם עולה על גודל הנקבוביות הקפסולה מודרים 5. הנה, אנחנו מראששלח את הגישה לתרבות להבדיל hESC נוירונים התובע ב microenvironment 3D באמצעות microcapsules אלגינט. יש לנו תרבות שונה התנאים 2 כדי לשפר את הכדאיות של hESC כמוס. הראינו בעבר כי תוספת של p160-Rho הקשורים מעכבי קינאז סליל מפותל, (רוק), Y-27632 ואנושי בינוני העובר פיברובלסטים אוויר החלפת בסרום (hFF-CM) לפלטפורמה 3D משופרת באופן משמעותי את הכדאיות של hESC Encapsulated שבו התאים לידי ביטוי מוחלטות סמן גנים האנדודרם 1. השתמשנו עכשיו זה פלטפורמה להפצת 3D של בידול hESC ויעיל נוירונים התובע. חלבון הגן ניתוחים ביטוי לאחר השלב האחרון של בידול התובע העצבית הראו ביטוי מוגבר של hydroxylase טירוזין (ה '), הסמן של התובע נוירונים,> 100 קפלי לאחר 2 שבועות. החוקרים שיערו כי הפלטפורמה שלנו 3D באמצעות microcapsules אלגינט אולי כדאי ללמוד את התפשטות וביים בידולשל hESC כדי שושלות שונות. מערכת 3D גם מאפשר הפרדת תאים מזין מן hESC במהלך תהליך של התמיינות, וכן יש פוטנציאל בידוד-החיסונית בעת השתלת בעתיד.
Protocol
כל ההנחיות המפורטות להלן מתבצעות באמצעות טכניקות אספטיים בתוך השנייה מחלקה biosafety הממשלה. חומרים כימיים וציוד המשמשים מפורטים בטבלה שלהלן.
1. הכנת אלגינט 1.1% (W / V)
- הוסף 0.275 גרם של נתרן אלגינט מטוהרים (glucuronic גבוהה חומצה תוכן ≥ 60%, צמיגות> 200 מגפ"ס S, ו רעלן פנימי ≤ 100 האיחוד האירופי / g) בצינור סטרילי 50 מ"ל ולהוסיף 25 מ"ל פתרון סטרילי ג'לטין 0.1% הכין קודם לכן (0.5g gelatin/500 מ"ל אלפית ש H 2 O ו מומס על ידי מעוקר).
- המערבולת צינור כ 30 שניות כדי להמיס את האבקה חלקית אלגינט ואז למקם את הצינור על מערבל מסלולית ב XG 10 את הלילה (בטמפרטורת החדר).
- הוספת 2.778 מ"ל של NaCl סטרילית 9% (4.5 גרם של NaCl/50 מ"ל אלפית ש H 2 O) ל 25 מ"ל של תמיסת אלגינט. המערבולת צינור כ 30 שניות ואחריו צנטריפוגה ב XG 95 דקות 5.
- אחסן את הפתרון אלגינט ב 4 °; C לאחסון לטווח קצר (1-2 חודשים) או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך (כשנה).
2. הכנת אמבט 2 רטיבות CaCl
- ממיסים 14.7 גרם של CaCl 2. 2H 2 O ו - 2.38 גרם של HEPES ב 1 ליטר של אלפית ש H 2 O.
- להתאים את רמת החומציות ל 7.4.
- לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון.
- רטיבות אמבטיה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים).
3. הכנת Decapsulating פתרון
- ב 500 מ"ל של פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (D-PBS), מוסיפים 50 מ"ל של EDTA 0.5m ו 5 מ"ל של HEPES 1M.
- לעקר באמצעות מסנן או 0.22 מיקרומטר החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- אחסן את הפתרון decapsulating בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים).
4. הכנת סרום החלפת בינוני (SR)
- לפני אנקפסולציה, להכין בינוני SR מראש כמו דהscribed בטבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד.
5. הכנת אינהיביטור רוק (Y-27632)
- לדלל Y-27632 אבקת ב 0.1% האנושי סרום אלבומין (HSA) ב D-PBS לעשות פתרון 5 מ"מ.
6. הכנת hESC אנקפסולציה
- הטיפול המקדים תאים עם התקשורת culturing השלימו עם 10 מיקרומטר של מעכב רוק (RI) במשך שעתיים ב -37 מעלות צלזיוס (הגנה מן האור).
- לאחר הטיפול RI, לשטוף את התאים עם D-PBS פעמיים לסלק את התאים מצלחות תרבות enzymatically עם accutase 10 דקות ב 37 ° C.
- בעדינות לגרד את התאים עם פיפטה מגרד או תא ולאסוף בצינור 15 מ"ל. לנטרל את accutase עם המדיום SR ביחס 1:1.
- כדי להכין את ההשעיה תא בודד, לסנן את התאים מנוטרלים באמצעות מסנן 40 מיקרומטר ולאסוף ב צינור צנטריפוגות טרי 50 מ"ל.
- לחשב את המספר הכולל של תאים בתמיסה באמצעות hemacytometer. בצנטריפוגה ההשעיה התא XG 95 דקות 5 ובזהירות לבטל supernatant לאחר מכן. שוטפים את התאים עם מחומם מראש NaCl 0.9%. סרכזת XG 95 דקות 5 וזורקים supernatant.
7. אנקפסולציה של תאים
- להכין מזרק 1 מ"ל מחובר צינור פלסטיק רך של 14 גר קטטר X 2 ד ". זה משמש לשאוב ההשעיה התא להיות טעון על משאבת מזרק כפי שמוצג באיור 1.
- Resuspend את התאים עם פתרון מחומם מראש אלגינט בצפיפות של 1.25 מיליון תאים / מ"ל אלגינט. מערבבים בעדינות עם מזרק ולמנוע יצירת בועות.
- הגדרת גנרטור חרוז, משאבת מזרק מד זרימת אוויר, כפי שמוצג באיור 1. פרטים נוספים של מכשירים אלה מוצגים לפי טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד.
- עם התאים aspirated לתוך מזרק, לבטל את צינורות הפלסטיק של קטטר IV ולצרף את המזרק מכונת אנקפסולציה. ודא כי קיים פער 10 ס"מ להיות tween בסופו של המכונה אנקפסולציה ונקודת איסוף כפי שמוצג באיור 1.
- לתמצת את התאים על ידי הגדרת משאבת מזרק בשיעור 20 מ"ל אוויר / שעה, הזרימה ב L 8 / דקה ואת הלחץ של kPa 100 (בגודל של קפסולות ניתן לשנות על ידי שינוי קצב זרימת אוויר).
- אוספים את התאים כמוס לתוך צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) מלא 20 מ"ל של אמבטיה מחומם מראש משקעים דקות 7 לייצב את הכמוסות.
- להעביר את התאים כמוס על ידי שאיפה עדינה לתוך 50 מ"ל צנטריפוגות מבחנות מלאות 20 מ"ל של 0.9% NaCl.
- אפשר הכמוסות להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור ואז להשליך בעדינות supernatant. חזור על תהליך הכביסה עם NaCl 0.9%.
- Resuspend התאים הגלום בינוני מחומם מראש culturing השלימו עם RI (10 מיקרומטר), להעביר לתוך הבקבוק תרבות מודגרות ב 37 ° C / 5% CO 2.
8. דיפרנציאציה של hESC Encapsulated כדי DA נוירונים
ve_content "> hESC Encapsulated מטופלים עם RI במשך 3 ימים לפני בידול.- זרע העכבר קו סטרומה התא, PA6 תאים בצפיפות של 1.0 x 10 4 ל 2 ס"מ ב 0.1% ג'לטין מצופה T75 בקבוק ומצבו את PA6 תאים בינוניים בידול התובע עצבית (טבלה חומרים) 24 שעות לפני בידול.
- להעביר את הכמוסות לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל ולאפשר להם להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור.
- מחק supernatant ו resuspend את הכמוסות במדיום PA6 DA תא ממוזג בידול עצבית.
- תרבות hESC במארז עם monolayer PA6 תאים (9 x 10 6 hESCs ל 7.5 x 10 5 PA6 תאים) במשך 28 ימים עם שינוי המדיה ביום 4 וכל כמה ימים לאחר מכן (לשנות רק מחצית בינונית בכל פעם).
- לאחר 3 שבועות בתרבות עם PA6 תאים, להשלים את המדיום התובע בידול עצבית עם 100 ng / mL ששש ו 100 ng / mL FGF8a שבוע הנותר.
9. Decapsulation של hESC Encapsulated
- לשאוב את הכמוסות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ולאפשר להם להתיישב בחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן לבטל את supernatant בזהירות.
- לשטוף את הכמוסות עם D-PBS פעמיים. בואו הכמוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור ולאחר מכן להסיר את supernatant.
- הוסף 5 מ"ל פתרון decapsulating על קפסולות. מערבבים את ההשעיה באופן יסודי באמצעות שאיפה לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דק '.
- בצנטריפוגה תאים decapsulated XG ב 95 דקות 3 וזורקים supernatant.
- לשטוף את התא גלולה עם D-PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 95 דקות 3. חזור.
- התאים decapsulated יכול להיות מתורבת יותר כמו monolayer או להשתמש בהם ניתוח במורד הזרם.
10. נציג תוצאות
הקוטר של microcapsules אלגינט הוא 400-500 מיקרומטר. מספר התאים בתוך הקפסולה היתה estimatאד על ידי חישוב המספר הכולל של תאים מחולק במספר הכולל של קפסולות בכל ריצה. לכן, כ 5.0 x 10 4 תאים בכל כמוסה הוערך. מכאן, אנו מעריכים כי המספר המרבי של הקפסולה תאים יכול להכיל הוא כ 1.0 x 10 5. הכדאיות של hESC במארז הוא> 80% (איור 2) כפי שנקבע על ידי שימוש באמצעות diacetate carboxyfluorescein succinimidly אסתר (CFDA) / יודיד propidium (PI) assay. אנחנו מותאם לתנאי אנקפסולציה hESC ידי הפחתת ריכוז אלגינט מ 2.2% עד 1.1% ועל ידי שינוי אמבטיה המשקעים בריום כלוריד כדי סידן כלוריד. מתוך תנאים אלו, אנו מראה כי רק את התאים אשר היו ארוזים עם אלגינט סידן 1.1% הצליחו לשרוד, להתרבות וליצור EBS במבחנה 1. כדי לייעל עוד יותר את המצב, ההשפעות של המדיה culturing ו RI, Y-27632 נחקרו. הנתונים כפי שהוצגו באיור 2 ו 3 מראים כי prevente RIד דיסוציאציה הנגרמת אפופטוזיס ומתוחזק על כדאיות התא והיווצרות אשכול לקדם 1,6. יתר על כן, את הכדאיות של hESC Encapsulated בתרבית RI + hFF-CM היה גבוה באופן משמעותי מאשר קבוצות אחרות ללא תוספת RI, אך זה לא היה שונה באופן משמעותי hESC Encapsulated בתרבית RI + SR. כמו כן, התפשטות תאים באמצעות assay BrdU עלה מ 25% עד 75% כמו תאים בודדים התפתח אשכולות (איור 3). Assay אפופטוזיס על ידי TUNEL גילה כי תאים בודדים microcapsules בתרבית בינוני SR היו אפופטוטיים (מידע לא מוצג) ואילו אשכולות שנמצאו CM-hFF היו שליליות בעיקר TUNEL. במידה מסוימת, hFF ס"מ בתוספת bFGF גם קידם הישרדות ריבוי hESCs הגלום בהיעדר Y-27632. עם זאת, הטיפול ב-Y לפני 27,632 (2 שעות) ואחרי אנקפסולציה (למשך 4 ימים נוספים) משופרת במידה ניכרת, הכדאיות שגשוג היווצרות אשכול hESC Encapsulatedב microcapsules אלגינט 1.1% סידן.
בעבר הראינו כי hESC במארז יכול להיות מובחן בהצלחה האנדודרם סופי 1. כאן בדקנו את היישום של אנקפסולציה תא כפלטפורמה 3D להבדיל hESC Encapsulated בתוך הנוירונים התובע. hESC, שיצר גופים embryoid (EB) בכמוסות היו ישירה מבודל על decapsulation בתנאים המתוארים הראו מורפולוגיה עצבית מתקדמת (איור 4) לאחר 2-3 ימים של תרבות עם כדאיות יותר מ 90%. ניתוח Gene הביטוי הראה את ויסות של סמן pluripotent, OCT4 תוך ציון neuroprogenitor, PAX6 ו סמן התובע העצבית, TH עלו ב-מוסדר לאחר 7 ימים של בידול (5 א 'איור). מכתים Immunofluorescent גילה כי hESC הבדיל היו PAX6 חיובי (> 80%), אך OCT4 שלילית ביום 7. HESC מובחן נוסף הראה TH-חיוביות (> 90%) נוירונים לאחר 21 יום (5 ב איור). ניתוח המערבי כתם הראה גםאת ויסות הביטוי TH מיום 14 (איור 5 ג) תוך PAX6 הביטוי היה למטה מוסדר אחרי יום 21. לעומת זאת, התאים בתרבית תחת סביבת דו ממדי (2D) בתנאים דומים (למשל RI לפני הטיפול 2 שעות ו RI שלאחר הטיפול במשך 3 ימים לפני התמיינות) שמר על אחוז גבוה של תאים PAX6 חיובי (> 80 %) במשך כל תקופת בידול ולא היו יעילים כמו הבחנה כדי TH-חיוביות תאים (<60%) כמו בסביבת 3D מסופק על ידי אנקפסולציה (איור 5 א 'ו - ג').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר מחקרים באמצעות העכבר גזע עובריים לתאים hESC הוכיחו את היתרונות של מערכת התרבות 3D ב biomaterials והנדסת רקמות 2,3. השתמשנו אלגינט microcapsules סידן כפלטפורמה 3D מתאים ללמוד התפשטות hESC והבחנה בהשוואה אלגינט בריום מאז hESC הראו כדאיות גבוהה יותר משמעותית כאשר הגלום אלגינט סידן מאשר אלגינט בריום. מערכת זו מאפשרת גם תרבות תרבות גבוהה צפיפות התאים וחילופי חומרי מזון וחמצן דרך הממברנה 7. התמיינות ספונטנית בתוך הכמוסות נצפתה קודם לכן ההנחה היא כי ככל hESC מובחן ממשיכים להתרבות בתוך הכמוסות, התאים היו בסופו של דבר הפריצה של כמוסות תפלצת רוחנית טופס 1. אחר יישום קליני של אנקפסולציה היא לספק הגנה חיסונית של התאים המושתלים של הנמען המארח. זה צפוי כי השתלה של hESC ו הנגזרים eir עלול להביא לדחיית החיסונית מאז רמה נמוכה של ביטוי של מעמד MHC אני אנטיגנים של hESC מובחן הוא גדל לאחר התמיינות 8. כמו כן תועד כי השתלת בדרך כלל מנצל ריכוזים גבוהים יותר של אלגינט, כדי לעקוף את תהליך דחייה של מערכת החיסון 2,9. המחקר שלנו משתמשת ריכוז נמוך יותר של אלגינט (1.1%) אשר מתאים יותר בתרבות במבחנה התמיינות של hESC. זה עדיין לא נקבע אם ריכוז נמוך יותר של אלגינט השתמשנו היה בלתי חוקי בתגובה החיסונית דומה בעבר דוחות, כמו גם שמירה על כדאיות התא צריך אלה hESC Encapsulated להיות מושתלים המארח immunocompetent.
פרוטוקול אנקפסולציה אופטימיזציה שלנו בבועה hESC מייצרת קפסולות בגודל של מיקרומטר קוטר 400-500. קפסולות שהם קטנים מ -400 מיקרומטר נוטים להיות בעלי פחות תאים תוך קפסולות גדולות יותר (> 500 מיקרומטר) resulלא של התפוצצות אוכלוסין של תאים. אנקפסולציה hESC דורש היווצרות תא בודד, אשר גם מקדמת אפופטוזיס בתא 6. הראינו כאן hESC Encapsulated יכול להמשיך לשרוד, להתרבות וליצור EB. זו מוגברת על ידי מראש בטיפול hESC עם RI לפני אנקפסולציה, וכתוצאה מכך> hESC 80% להיות בת קיימא. לכן, הקמנו מודל hESC התרבות בתנאים תרבות 3D ו הרחיבו את המחקרים הללו על בידול מכוון אל הנוירונים התובע. למרות אנקפסולציה טכניקה התא כבר נרחב ידוע culturing תאים והתמיינות endodermal, בידול עצבית בתנאים אלה לא נחקר באופן יסודי 10,11. הראינו כאן כי יש ביטוי מוגבר של PAX6 ו TH באמצעות גנים וחלבונים ניתוחים ביטוי לאחר 7 ימים בהשוואה למערכת בידול 2D, דבר המצביע על כך 3D הסביבה מקדם טוב יותר השושלת העצבית התובע מהמדינה pluripotent. עם זאת, suc ניתוחים נוספיםH כמבחן הפרשת דופאמין assay השתלת נדרשים לאפיין באופן מלא את התאים הבדיל. יצירת נוירונים חזקים תפקודית התובע יעיל הוא תנאי הכרחי אם טיפול בתאי עבור מחלת פרקינסון היא להפוך למציאות. הפלטפורמה שלנו 3D כפי שהוצע על culturing בשיתוף עם תאים עצביים, התובע וישכנע PA6 תאים בצפיפות גבוהה תרבית תאים של מערכת העצבית hESC התובע מובחן באמצעות אנקפסולציה הוא מאמץ לכיוון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית NHMRC גרנט # 568969 (PSS) ו הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת New South Wales, יוזמת לתאי גזע (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
