Summary
Vi har optimalisert en microencapsulation teknikk som en effektiv 3D plattform for spredning og differensiering av embryonale stamceller til endoderm og dopaminerge (DA) nerveceller. Det gir også en mulighet for immun-isolering av celler fra verten i transplantasjon. Denne plattformen kan tilpasses andre celletyper.
Abstract
Humane embryonale stamceller (hESC) er fremstår som et attraktivt alternativ kilde for celle erstatning terapi siden de kan bli utvidet i kultur ubestemt tid og differensiert til eventuelle celletyper i kroppen. Ulike typer biomaterialer har også blitt brukt i stamcelle kulturer for å gi en mikromiljøet etterligne stamcelleforskningen nisje 1-3. Sistnevnte er viktig for å fremme celle-til-celle interaksjon, celleproliferasjon og differensiering inn i spesifikke linjene samt vev organisering ved å tilby en tredimensjonal (3D) miljø 4 som innkapsling. Prinsippet om cellen innkapsling innebærer entrapment av levende celler innenfor rammen av semi-permeable membraner i 3D kulturer 2. Disse membranene tillater utveksling av næringsstoffer, oksygen og stimuli på tvers av membraner, mens antistoffer og immunceller fra verten som er større enn kapselen porestørrelse er ekskludert fem. Her forhåndsinstallert visendte en tilnærming til kultur og differensiere hESC DA nevroner i en 3D mikromiljøet hjelp alginat mikrokapsler. Vi har endret de kultur vilkår 2 for å forbedre levedyktigheten til innkapslede hESC. Vi har tidligere vist at tillegg av P160-Rho-assosiert coiled-coil kinase (ROCK) hemmer, Y-27632 og human føtal fibroblast-condition serum erstatning medium (HFF-CM) til 3D-plattformen betydelig forbedret levedyktighet innkapslede hESC der cellene uttrykte definitive endoderm markør gener en. Vi har nå brukt denne 3D plattform for spredning av hESC og effektiv differensiering til DA nerveceller. Protein og genekspresjon analyser etter den siste etappen av DA neuronal differensiering viste en økt uttrykk av tyrosin hydroksylase (TH), en markør for DA nevroner,> 100 folder etter 2 uker. Vi hypotesen at vår 3D plattform ved hjelp av alginat mikrokapsler kan være nyttig å studere spredning og regissert differensieringav hESC til ulike linjene. Denne 3D Systemet tillater også separasjonen av materen celler fra hESC under prosessen for differensiering, og har også potensial for immun-isolering under transplantasjon i fremtiden.
Protocol
Alle prosedyrene nedenfor er utført ved hjelp av aseptisk teknikk inne i en klasse II biosikkerhet Cabinet. Reagenser og utstyr brukt, er oppført i tabellene nedenfor.
1. Utarbeidelse av 1,1% Alginat (w / v)
- Legg 0.275 g renset natrium alginate (høy glukuronsyre innhold ≥ 60%, viskositet> 200 mPa s, og endotoksin ≤ 100 EU / g) i en steril 50 ml tube og tilsett 25 ml steril 0,1% gelatin løsning forberedt tidligere (0,5 g gelatin/500 ml Milli-Q H 2 O og oppløst ved autoklavering).
- Vortex røret i ca 30 sekunder å delvis oppløse den alginat pulveret plasser deretter røret på en orbital mixer ved 10 xg for natten (romtemperatur).
- Legg 2.778 ml 9% steril NaCl (4,5 g NaCl/50 ml milli-Q H 2 O) til 25 ml av alginat løsning. Vortex røret i ca 30 sekunder, etterfulgt av sentrifugering ved 95 xg i 5 min.
- Oppbevar alginat løsning ved 4 °; C for kortsiktig oppbevaring (1-2 måneder) eller ved -20 ° C for langtidslagring (om et år).
2. Utarbeidelse av CaCl 2 Nedbør Bath
- Løs opp 14,7 g CaCl 2. 2H 2 O og 2,38 g av HEPES i 1 liter milli-Q H 2 O.
- Juster pH nivået til 7,4.
- Steriliser løsningen ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter.
- Nedbør bad kan oppbevares i romtemperatur (6-12 måneder).
3. Utarbeidelse av Decapsulating Solution
- I 500 ml Dulbecco sin Fosfatbufret saltvann (D-PBS), tilsett 50 ml 0.5M EDTA og 5 ml 1M HEPES.
- Sterilisere med en 0,22 mikrometer filter eller autoklav ved 121 ° C i 20 min.
- Oppbevar decapsulating løsningen ved romtemperatur (6-12 måneder).
4. Utarbeidelse av Serum Replacement (SR) Medium
- Før innkapsling, forberede SR medium på forhånd som debeskrevet i Tabell av spesifikke reagenser og utstyr.
5. Utarbeidelse av ROCK Inhibitor (Y-27632)
- Fortynn Y-27632 pulver i 0,1% humant serum albumin (HSA) i D-PBS for å lage en 5 mM løsning.
6. Utarbeidelse av hESC for Encapsulation
- Pre-treat cellene med dyrking media supplert med 10 mm fra Rock inhibitor (RI) for to timer ved 37 ° C (beskytte mot lys).
- Etter RI behandling, vask celler med D-PBS to ganger og løsne cellene fra kultur plater enzymatisk med accutase i 10 min ved 37 ° C.
- Forsiktig skrape cellene med pipette eller celle skraper og samles i en 15 ml tube. Nøytralisere accutase med SR medium i forholdet 1:1.
- For å forberede en enkelt celle suspensjon, filtrere nøytraliserte celler ved hjelp av en 40 mikrometer filter og samle i en fersk 50 ml sentrifugerør.
- Beregn det totale antall celler i løsningen ved hjelp av en hemacytometer. Sentrifuger cellesuspensjonen 95 xgi 5 min og forsiktig kast supernatanten etterpå. Vask cellene med forvarmes 0,9% NaCl. Sentrifuger 95 xgi 5 min og kast supernatanten.
7. Innkapsling av celler
- Forbered en 1 ml sprøyte festet til en myk plast rør 14g x 2 "IV kateter. Dette brukes til å suge cellesuspensjonen å lastes på sprøyten pumpen som vist i Figur 1.
- Resuspender cellene med forvarmes alginat-løsning til en tetthet på 1,25 millioner celler / ml alginat. Bland forsiktig med sprøyten og unngå å skape bobler.
- Sett opp perle generator, sprøyten pumpen og luftstrømmen meter som vist i Figur 1. Flere detaljer om disse enhetene er listet opp i tabell med spesifikke reagenser og utstyr.
- Med de cellene som dråper i sprøyten, kastes plastrør av IV kateter og fest sprøyten til innkapsling maskinen. Kontroller at det er 10 cm gap være Tween slutten av innkapsling maskinen og returpunkt, som vist i Figur 1.
- Kapsle cellene ved å sette sprøyten pumpen ved 20 ml / t, luftmengde ved 8 L / min og et trykk på 100 kPa (på størrelse med kapsler kan endres ved å endre luftmengde).
- Samle den innkapslede cellene inn i en petriskål (100 x 15 mm) fylt med 20 ml forvarmes ventet bad for 7 min å stabilisere kapslene.
- Overfør den innkapslede cellene ved forsiktig aspirasjon til 50 ml sentrifugerør fylt med 20 ml 0,9% NaCl.
- La kapslene å bosette seg i bunnen av røret så forsiktig kast supernatanten. Gjenta vaskeprosessen med 0,9% NaCl.
- Resuspender den innkapslede cellene i forvarmes dyrkning medium supplert med RI (10 mm), overføring til en kultur flaske og inkubert ved 37 ° C / 5% CO 2.
8. Differensiering av Encapsulated hESC til DA Neurons
ve_content "> Den innkapslede hESC behandles med RI i 3 dager før differensiering.- Seed musen stromal cellelinje, PA6 cellene ved en tetthet på 1,0 x 10 4 per cm 2 i 0,1% gelatin-belagt T75 kolbe og tilstand de PA6 cellene i DA neural differensiering medium (Materials tabell) 24 timer før differensiering.
- Overfør kapsler til en 50 ml sentrifugerør og tillate dem å bosette seg i bunnen av røret.
- Kast supernatanten og resuspender kapslene i PA6 celle-conditioned DA neural differensiering medium.
- Kultur den innkapslede hESC med PA6 cellen monolayer (9 x 10 6 hESCs per 7,5 x 10 5 PA6 celler) i 28 dager med en media endring på dag 4 og annenhver dag etterpå (endre bare halvparten av medium hver gang).
- Etter 3 uker i kultur med PA6 celler, supplere DA nevrale differensiering medium med 100 ng / ml ssh og 100 ng / ml FGF8a for den resterende uken.
9. Decapsulation av Encapsulated hESC
- Sug kapslene inn i en 15 ml sentrifugerør og tillate dem å slå seg ned ved bunnen av røret. Så kast supernatanten forsiktig.
- Vask kapslene med D-PBS to ganger. La kapsler bosette i bunnen av røret og fjern supernatanten.
- Tilsett 5 ml decapsulating løsning på de kapslene. Bland suspensjonen grundig via aspirasjon før inkubasjon ved romtemperatur i 4-5 min.
- Sentrifuger decapsulated cellene ved 95 xg for 3 min og kast supernatanten.
- Vask cellepelleten med D-PBS etterfulgt av sentrifugering ved 95 xg for 3 min. Gjenta.
- De decapsulated cellene kan bli ytterligere kultivert som en monolayer eller brukes til nedstrøms analyse.
10. Representative Resultater
Diameteren på alginat mikrokapsler er 400-500 mikrometer. Antall celler innenfor kapselen var estimated ved å beregne det totale antall celler dividert med totalt antall kapsler per løp. Derfor ble omtrent 5,0 x 10 4 celler per kapsel anslått. Fra dette, antar vi at det maksimale antall celler kapselen kan inneholde, er ca 1,0 x 10 5. Levedyktigheten til innkapslet hESC er> 80% (figur 2) som bestemmes ved hjelp av å bruke carboxyfluorescein diacetat succinimidly ester (CFDA) / propidium jodid (PI) assay. Vi har optimalisert vilkårene hESC innkapsling ved å redusere alginat konsentrasjonen fra 2,2% til 1,1% og ved å endre nedbøren badet fra barium chloride til kalsiumklorid. Fra disse forholdene, viste vi at bare de cellene som ble innkapslet med 1,1% kalsiumalginatpinner kunne overleve, spre og danne EBS in vitro en. For ytterligere å optimalisere tilstanden, effekten av dyrking media og RI ble Y-27632 undersøkt. Dataene som presenteres i figur 2 og 3 viser at RI prevented dissosiasjon-indusert apoptose og vedlikeholdt celleviabilitet og fremmet cluster formasjon 1,6. Videre var levedyktigheten innkapslede hESC dyrket i HFF-CM + RI betydelig høyere enn andre grupper uten RI tilskudd, men dette var ikke signifikant forskjellig å innkapslet hESC dyrket i SR + RI. Tilsvarende økte celleproliferasjon hjelp BrdU analysen fra 25% til 75% som enkeltceller utviklet i klynger (Figur 3). Apoptose analysen av Tunel avslørte at enkeltceller i mikrokapsler dyrket i SR medium var apoptotisk (data ikke vist), mens de hentede klynger fra HFF-CM var for det meste negative for Tunel. Til en viss grad, HFF-CM supplert med bFGF også fremmet overlevelse og spredning av innkapslede hESCs i fravær av Y-27632. Men behandling med Y-27632 før (2 timer) og etter innkapsling (for ytterligere 4 dager) markert forbedret levedyktighet, spredning og klynge dannelse av innkapslede hESCi 1,1% kalsiumalginatpinner mikrokapsler.
Tidligere har vi vist at innkapslede hESC kan med hell differensieres til definitive endoderm en. Her undersøkte vi anvendelse av cellen innkapsling som en 3D-plattform for å differensiere innkapslet hESC inn DA nerveceller. hESC, som dannet embryoid organer (EB) i kapsler var direkte differensiert og på decapsulation på de vilkår som er beskrevet viste en progressiv neuronal morfologi (Figur 4) etter 2-3 dager med kultur med mer enn 90% levedyktighet. Genekspresjonsanalyse viste en nedregulering av pluripotent markør, OCT4 mens neuroprogenitor markør, PAX6 og DA neuronal markør, TH var oppregulert etter 7 dager med differensiering (Figur 5A). Immunofluorescent farging avdekket at differensiert hESC var PAX6-positive (> 80%), men OCT4-negativ på dag 7. Videre differensiert hESC viste TH-positive (> 90%) nevroner etter 21 dager (figur 5B). Western blot analyse viste ogsåen oppregulering av TH uttrykk fra dag 14 (figur 5C) mens PAX6 uttrykk var nedregulert etter dag 21. Til sammenligning cellene dyrkes under to-dimensjonale (2D) miljø under lignende forhold (for eksempel RI pre-behandling for 2 timer og RI etter behandling i 3 dager før differensiering) opprettholdt en høy andel av PAX6-positive celler (> 80 %) i hele differensiering perioden og var ikke så effektivt i å skille til TH-positive celler (<60%) som i 3D miljøet levert av innkapsling (Figur 5A og C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere studier ved hjelp av musen embryonale stamceller og hESC har demonstrert nytten av 3D kultur system i biomaterialer og tissue engineering 2,3. Vi brukte kalsiumalginatpinner mikrokapsler som et egnet 3D plattform for å studere hESC forplantning og differensiering i forhold til barium alginat siden hESC viste signifikant høyere levedyktighet når innkapslet i kalsiumalginatpinner enn barium alginat. Denne kulturen Systemet tillater også en høy tetthet cellekultur og utveksling av næringsstoffer og oksygen over membranen 7. Spontan differensiering innenfor de kapslene tidligere har vært observert og det antas at så udifferensiert hESC fortsetter å spre seg innenfor de kapslene, cellene til slutt ville utbrudd av kapsler og skjema teratom en. En annen klinisk anvendelse av innkapsling er å gi immun beskyttelse av transplanterte celler fra verten mottakeren. Det er forventet at transplantasjon av hESC og thEir derivater kan føre til immunologiske avslag fordi det lave nivået av uttrykk for MHC klasse I antigener av udifferensiert hESC er økt etter differensiering 8. Det har også blitt dokumentert at transplantasjon vanligvis benytter høyere konsentrasjoner av alginat for å omgå immunforsvaret avslaget prosessen 2,9. Vår studie benytter en lavere konsentrasjon av alginat (1,1%) som er mer egnet for in vitro kultur og differensiering av hESC. Det er ennå ikke bestemt om lavere konsentrasjon av alginat vi har brukt ville ulovlig en lignende immunrespons som tidligere rapporter samt opprettholde celleviabilitet bør disse innkapslet hESC bli transplantert i en immunkompetente vert.
Vår optimalisert innkapsling protokoll for innkapsle hESC produserer kapsler størrelse på 400-500 mikrometer diameter. Kapsler som er mindre enn 400 mikrometer tendens til å ha færre celler mens større kapsler (> 500 mikrometer) result i en overbefolkning av celler. hESC innkapsling krever en enkelt celle formasjon, noe som også fremmer celle apoptose 6. Vi har vist her at innkapslede hESC kan fortsette å overleve, spre og danne EB. Dette forsterkes av pre-behandle hESC med RI før innkapsling, noe som resulterer i> 80% hESC være levedyktig. Derfor har vi etablert en modell for kultur hESC i 3D kultur forhold og har utvidet disse studiene for rettet differensiering i DA nerveceller. Selv celle innkapsling teknikken har blitt viden kjent for celledyrking og endodermal differensiering, nevrale differensiering under disse forholdene har ikke vært undersøkt grundig 10,11. Vi har vist her at det er en økt uttrykk av PAX6 og TH bruker genet og protein uttrykk analyser etter 7 dager i forhold til 2D differensiering system, noe som tyder på at 3D-miljøet fremmer bedre DA neuronal avstamning fra pluripotent tilstand. Men videre analyser such som dopamin sekresjon test og transplantasjon analysen er nødvendig for å fullt ut karakterisere de differensierte cellene. Generere robuste funksjonelle DA nevroner er effektivt et grunnleggende krav om cellen terapi for Parkinsons sykdom er å bli en realitet. Vår 3D-plattform som foreslått om co-dyrkning med DA nevrale induserende celler, PA6 celler og høy tetthet cellekultur system av DA neuronal differensiert hESC via innkapsling er en innsats mot den retningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NHMRC Program Grant # 568969 (PSS) og Det medisinske fakultet, Universitetet i New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
