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Biology

在所有人类染色体24 chromosomics:检测的数值模拟和结构上的改动同时使用一种新型OctoChrome鱼含量

doi: 10.3791/3619 Published: February 6, 2012

Summary

一种新型的荧光

Abstract

荧光原位杂交(FISH)是一种技术,使特定的DNA序列,中期或相间染色体检测细胞核1。该技术采用独特的序列杂交,整条染色体或特定的染色体区域的DNA探针,作为一个强大的辅助经典遗传学。例如,许多早期的研究报告中增加相关的白血病患者接触苯,苯中毒患者,接触苯的健康工人的染色体畸变的频繁检测,采用经典遗传学分析2。使用鱼,已观察到白血病特定染色体改变升高,显然健康的工人暴露于苯3-6,说明在苯致白血病细胞遗传学改变的关键角色。

一般来说,一条鱼检测只检查一个或几个整条染色体或每张幻灯片的特定基因,使多个杂交需要进行多张幻灯片,涵盖所有人类染色体。光谱核型分析(SKY)允许可视化的整个基因组的同时,但要求特殊的软件和设备的限制及其应用7。在这里,我们描述了一种新的鱼类试验,OctoChrome鱼,可用于Chromosomics的应用,这是我们定义为所有人类染色体24上的一个广泛的染色体非整倍体的研究,人类的研究,如幻灯片同步分析(CWAS) 8。作为Chromoprobe多功能系统由Cytocell上市的方法,基础是OctoChrome的的设备,被划分成8个广场,每个带有三种不同的整条染色体涂染探针(图1)。三个探头都直接标有不同颜色的荧光,绿色(FITC标记),红(得克萨斯红),蓝(香豆素)。染色体组合的安排上OctoChromE设备已设计,以方便识别中最常见的白血病和淋巴瘤中发现的非随机的染色体结构改建(易位),实例t(9; 22),T(15 17),T(8; 21 ),T(14 18)9。此外,在染色体上的数值变化(非整倍体)可以同时检测。相应的模板幻灯片,也分为8到中期利差是约束(图2),定位在OctoChrome设备的平方。在高温和潮湿室杂交探针和目标DNA变性,然后所有人类染色体24同时可以可视化。

OctoChrome FISH技术是一种很有前途的技术为白血病和淋巴瘤的临床诊断和所有染色体的非整倍体的检测。我们已申请在研究苯暴露中国工人8,10 CWAS这个新Chromosomic方法。

Protocol

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1。样品幻灯片准备

  • OctoChrome鱼,旨在探讨在人体细胞,包括中期利差的染色体变化,但不限于外周血细胞培养,干/祖细胞和细胞株。样品应准备后的收获中期3,11-13的标准程序:采用秋水仙胺治疗逮捕中期,低渗处理的细胞肿胀细胞,卡诺的固定液固定在悬挂在约0.5-1×10 6个细胞的细胞每毫升。
  • 清理的8平方米的幻灯片(中的OctoChrome的套件,目录#:大马803 Cytocell有限公司,剑桥,英国,图2)纯乙醇浸渍2分钟。
  • 样本幻灯片之前,拖放到幻灯片少量的细胞,细胞密度检查。如果细胞密度过高(太多的重叠细胞),与新鲜固定液稀释暂停。如果细胞的密度太低(太少细胞在幻灯片),自旋向下的细胞和重新暂停了新鲜固定液体积小。移液器5-10μL细胞悬液到8区交替广场1/7的序列模板幻灯片 - 2/8 - 3/5 - 4/6。一旦前两个广场已风干,发现以同样的方式,其余的广场。这将防止相互干扰细胞差。
  • 干幻灯片可以储存在-20°C氮气气氛中为杂交大于前5年。

2。中期使用自动化系统的本地化

  • 申请4',6-diamidino-2-苯基(0.2微克/毫升)20μL中心幻灯片各占一半,然后盖上盖玻片。
  • 执行自动扫描的样本幻灯片本地化使用Metafer软件(MetaSystems,Altlussheim,德国)的中期细胞。这有利于所有的中期和未来重新评估所有的细胞图像的位置。
  • 手动查看扫描结果,并删除非中期的文物。

3。杂交

  1. 制备的样品幻灯片和OctoChrome的设备
    • 样本幻灯片2X SSC缓冲液在室温下浸泡30分钟洗去的DAPI。
    • 通过一系列的乙醇洗涤(每2分钟在70%,85%和100%乙醇)脱水样品的幻灯片,让干燥,放置在37℃5分钟烤盘。
    • 在37℃水浴中放置的Chromoprobe多功能的杂交厅(提供在OctoChrome工具包),并允许以平衡至37°(+ / - 1℃)。
    • 通过反复的移液和每OctoChrome设备预温25μl的等分混合杂交液(在OctoChrome工具包提供)至37°C。
    • 预温暖每个OctoChrome装置(的OctoChrome套件提供,请参阅图2)至37°C的设备标签的一面朝下放在烤盘上。请勿触摸t他的OctoChrome设备的浮雕表面,因为它们含有的探头。
  2. 样品幻灯片在OctoChrome设备定位(图2)
    • 加入2μL预热的杂交液前的的温暖OctoChrome设备的八个方面,而它仍然在37°C。
    • 仔细颠倒,在OctoChrome设备,如数字1,现在是倒挂,是通过位于顶部的右手区的OctoChrome设备模板的幻灯片。为了帮助找到平方米1,其设备上的地位已被标记为橙色。
    • 确保该模板的幻灯片仔细对齐匹配上OctoChrome设备领域。仔细降低在OctoChrome设备的幻灯片,幻灯片接触,使杂交溶液滴。适用于温和,甚至施加压力,以确保杂交液蔓延到每个提出上OctoChrome设备领域的边缘。
    • 抬磨砂玻片年底的幻灯片/ OctoChrome的,小心翼翼地捧着,反转,使幻灯片下方OctoChrome设备。确保设备不涂抹整个模板幻灯片,因为这可能导致探针的交叉污染。
    • 广场上37°(+ / - 1℃)10分钟的烤盘。
  3. 变性
    • 样本幻灯片/ OctoChrome设备转移到烤盘,采取特别的护理,以保持它的水平。确保样本幻灯片均匀接触的烤盘。
    • 烤盘上的变性在75°C(+ / - 1℃)5分钟。
  4. 杂交
    • 在Chromoprobe多功能杂交商会的地方样品幻灯片/ OctoChrome的设备。
    • 替换盖和浮动室在37°(+ / - 1°C)水洗澡(非 - 搅拌)隔夜。请注意:请勿杂交室盖密封,切勿密封盖子上的水洗澡,不要在杂交孵化器。这些步骤是关键控制湿度。
  5. 杂交后,清洗
    • 洗液的制备
      解决方案1:含0.4倍SSC的准备Coplin / Hellendahl罐子。平衡到72°C间(+ / - 1℃)水浴中,并调整pH值至7.0。
      解决方案2:含2X SSC和0.05%吐温20准备Coplin / Hellendahl罐子。在室温下静置。
    • 从幻灯片仔细删除OctoChrome设备,并放置2分钟,在方案1的幻灯片。
    • 30秒的幻灯片放入解决方案2。

4。安装和结果的可视化

  • 20μL的DAPI应用中心幻灯片各占一半,并适用于盖玻片。
  • 荧光显微镜下观察,在黑暗中前10分钟,在室温下孵育。

5。代表结果

figu3A重新显示在正常的中期细胞广场2。 (1) - (3):8日,21日和12染色体被涂成红色,绿色和蓝色,德州红,FITC标记,和DEAC过滤器,分别是通过可视化;(4):通过的DAPI / FITC /可视化得克萨斯红三重过滤。一般来说,用蓝色画的染色体不明确,通过三重过滤,需要根据具体DEAC滤波器观看。

图3B显示代表特定的白血病染色体易位和非整倍体异常细胞。 (1):T(8; 21),一种常见的急性髓细胞性白血病染色体易位;(2):21三体综合征,21号染色体,在白血病的常见的非整倍体的三个副本。

图1

图1。染色体上的OctoChrome设备和预期的染色体绘画结果组合安排。

图2

图2。定位样本幻灯片在OctoChrome设备的。

代表结果如图3。获得OctoChrome鱼(方2)。

图3A

图3A,正常细胞与染色体8,12,21广场2画。

图3B

图3B。代表在广场与特定的白血病染色体易位和非整倍体异常细胞。

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Discussion

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这种新颖的OctoChrome鱼法允许同时在一张幻灯片上的单一杂交研究所有人类染色体24。 8平方的染色体组合的安排,已设计,以方便识别中最常见的白血病和淋巴瘤的非随机的染色体重排。因此,该法可检测数值(非整倍体)以及结构(易位)染色体的改变同时进行。

在这个实验中最关键的一步是控制湿度在过夜杂交在水浴浮动商会。 FISH探针和杂交缓冲容易干燥,如果湿度低,或成为吸收过多的水分太稀释,如果湿度高。这两种结果可能产生不利影响的结果。一个可能的修改,以克服这一挑战,是用胶带密封的OctoChrome设备和样品幻灯片和杂交37°,C烤盘在黑暗中过夜。

样品已经太多岁的幻灯片,可能不适合在本实验直接使用。虽然用胃蛋白酶消化这些样本将提高杂交,准备样品幻灯片储存在氮气气氛中,在-20°C的强烈建议,以尽量减少老化。

OctoChrome-FISH技术是一种很有前途的技术,为白血病和淋巴瘤的临床诊断。审议有关在暴露到潜在leukemogens和lymphomagens的人口和学习的非整倍体诱导作用的化学品在染色体的方式对人类白血病和淋巴瘤的最具体的染色体重排,这也是非常有用。我们以前CWAS使用这项技术的研究表明,某些染色体可能是多由接触苯8,10,一个主要的工业化学品和无处不在的环境污染物,导致人类白血病14人受影响。这种“选择性非整倍体”的现象可以探讨其他化学使用CWAS的风险。

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Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

作者希望感谢博士Cliona研究麦克海尔批判性阅读和编辑的稿件。这项工作是由美国国家环境健康科学,国家卫生研究所授予R01ES017452张为L研究所。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OctoChrome Kit Cytocell Ltd. PMP 803
phytohaemagglutinin (PHA) Invitrogen 10576-015
Colcemid Invitrogen 15212-012
Carnoy’s fixative Methanol : glacial acetic acid = 3: 1
Fluorescence microscope Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously
Metafer software MetaSystems, Altlussheim, Germany Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities

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References

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在所有人类染色体24 chromosomics:检测的数值模拟和结构上的改动同时使用一种新型OctoChrome鱼含量
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Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay. J. Vis. Exp. (60), e3619, doi:10.3791/3619 (2012).More

Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay. J. Vis. Exp. (60), e3619, doi:10.3791/3619 (2012).

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