Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome
Summary
Um de fluorescência romance<em> In situ</em> Hibridização (FISH) método que, simultaneamente, examina alterações cromossômicas, tanto numéricas e estruturais, particularmente as translocações específicas cromossômicas associados com leucemia e linfoma, de todos os 24 cromossomos humanos em um único dispositivo em uma hibridação, é descrito.
Abstract
De fluorescência de hibridização in situ (FISH) é uma técnica que permite que seqüências específicas de DNA a ser detectado em cromossomos metafásicos ou de interfase em núcleos de células 1. A técnica utiliza sondas de DNA com sequências únicas que hibridizam a cromossomos inteiros ou específicas regiões cromossômicas, e serve como um adjunct poderosa para citogenética clássicos. Por exemplo, muitos estudos anteriores relataram a ocorrência freqüente de aberrações cromossômicas maiores em pacientes com leucemia relacionados com exposição ao benzeno, benzeno envenenamento de pacientes e trabalhadores saudáveis expostos ao benzeno, utilizando análise citogenética clássica 2. Usando FISH, leucemia específicos alterações cromossômicas foram observadas a ser elevados em trabalhadores aparentemente saudáveis expostos ao benzeno 3-6, indicando os papéis críticos de mudanças citogênicas em benzeno induzida leucemogênese.
Geralmente, um teste FISH único examina apenas um ou poucos cromossomos inteirosou loci específicos por slide, etc hibridizações múltiplas precisam ser realizados em vários slides para cobrir todos os cromossomos humanos. Cariotipagem espectral (SKY) permite a visualização de todo o genoma simultaneamente, mas a necessidade de software especial e limitações do equipamento a sua aplicação 7. Aqui, descrevemos um teste FISH romance, OctoChrome FISH, que pode ser aplicado para Chromosomics, que definimos aqui como a análise simultânea de todos os 24 cromossomos humanos em um slide em estudos humanos, tais como estudo de todo o cromossomo aneuploidia (CWA) 8. A base do método, comercializado pela Cytocell como o Sistema de Multiprobe Chromoprobe, é um dispositivo de OctoChrome que está dividido em 8 quadrados, contendo cada um dos quais transporta três diferentes sondas cromossômicas inteiras de pintura (Figura 1). Cada uma das três sondas está diretamente rotulado com um fluoróforo colorido diferente, verde (FITC), vermelho (Texas Red), e azul (A cumarina). O arranjo de combinações cromossómicas sobre a OctoChrome dispositivo foi projetado para facilitar a identificação das não-aleatórias alterações cromossômicas estruturais (translocações) encontrados nas leucemias e linfomas mais comuns, por exemplo t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Além disso, mudanças numéricas (aneuploidia) em cromossomos pode ser detectada concorrentemente. O slide de modelo correspondente também é dividido em 8 quadrados sobre a qual spreads em metafase são vinculados (Figura 2), e é posicionado sobre o dispositivo de OctoChrome. As sondas e DNA-alvo são desnaturado a alta-temperatura e hibridizadas em uma câmara úmida, e, em seguida, todos os 24 cromossomos humanos podem ser visualizados simultaneamente.
FISH OctoChrome é uma técnica promissora para o diagnóstico clínico de leucemia e linfoma e para a detecção de aneuploidias em todos os cromossomos. Nós aplicamos esta nova abordagem cromossômica em um estudo CWA de benzeno expostos os trabalhadores chineses 8,10.
Protocol
Discussion
Este teste FISH-OctoChrome romance permite, simultaneamente, examinar todos os 24 cromossomos humanos em uma hibridação única em um slide. O arranjo de combinações cromossómicas sobre os 8 quadrados foi projetado para facilitar a identificação de os rearranjos não-aleatórios cromossómicas estruturais nas leucemias mais comuns e linfomas. Assim, o ensaio pode detectar numérica (aneuploidia), bem como estruturais alterações (translocações) cromossómicas concorrentemente.
O pas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. M. Cliona McHale pela leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, Instituto Nacional de Saúde para concessão R01ES017452 L Zhang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd, Cambridge, UK | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen Corporation | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen Corporation | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S., Barch, M. J. . In The ACT cytogenetics laboratory. , 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
