Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome
Summary
Un romanzo fluorescenza<em> In situ</emIbridazione> (FISH), metodo che prende in esame contemporaneamente sia alterazioni cromosomiche numeriche e strutturali, in particolare le specifiche traslocazioni cromosomiche associate a leucemia e linfoma, di tutti i 24 cromosomi umani su un singolo dispositivo in una ibridazione, è descritto.
Abstract
Ibridazione fluorescente in situ (FISH) è una tecnica che permette sequenze di DNA specifiche per essere rilevato su cromosomi in metafase o interfase in nuclei cella 1. La tecnica utilizza sonde di DNA con sequenze uniche che ibridano a interi cromosomi o specifiche regioni cromosomiche, e serve come un potente strumento in aggiunta alle classiche citogenetica. Per esempio, molti studi precedenti riportato la rilevazione frequente di aberrazioni cromosomiche aumento dei pazienti affetti da leucemia connessi con l'esposizione benzene, benzene-avvelenamento pazienti e lavoratori sani esposti a benzene, utilizzando l'analisi citogenetica classica 2. A base di pesce, alterazioni cromosomiche leucemia-specifici sono stati osservati per essere elevati nei lavoratori apparentemente sani esposti a benzene 3-6, indicando i ruoli critici dei cambiamenti cytogentic a benzene-indotta leucemogenesi.
In generale, un test singolo pesce prende in esame solo uno o pochi cromosomi pochi intereo loci specifici per vetrino, in modo ibridazioni più bisogno di essere condotta su più diapositive per coprire tutti i cromosomi umani. Cariotipo spettrale (SKY) permette di visualizzare contemporaneamente l'intero genoma, ma l'esigenza di un apposito software e attrezzature limiti la sua applicazione 7. Qui, descriviamo un nuovo metodo di analisi FISH, OctoChrome-FISH, che può essere applicato per Chromosomics, che definiamo qui come l'analisi simultanea di tutti i 24 cromosomi umani in una diapositiva in studi sull'uomo, come ad esempio il cromosoma studio a livello aneuploidia (CWA) 8. La base del metodo, commercializzato dalla Cytocell come il Sistema Multiprobe Chromoprobe, è un dispositivo OctoChrome che è divisa in 8 quadrati, ciascuno dei quali svolge tre diverse intere sonde pittura cromosomiche (Figura 1). Ciascuno dei tre sonde è marcato direttamente con un fluoroforo colore diverso, verde (FITC), rosso (Texas Red), e blu (cumarina). La disposizione di combinazioni cromosomiche sul OctoChromdispositivo e è stato progettato per facilitare l'identificazione delle non-casuali alterazioni cromosomiche strutturali (traslocazioni) che si trovano nei più comuni leucemie e linfomi, per esempio t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Inoltre, le variazioni numeriche (aneuploidia) nei cromosomi possono essere rilevati simultaneamente. La diapositiva corrispondente modello è anche diviso in 8 quadrati sulla quale sono vincolati in metafase (Figura 2), e sia posizionata sopra il dispositivo OctoChrome. Le sonde e DNA bersaglio sono denaturato ad alta temperatura e ibridato in una camera umida, e quindi tutte le 24 cromosomi umani possono essere visualizzati simultaneamente.
OctoChrome FISH è una tecnica promettente per la diagnosi clinica di leucemia e linfoma e per il rilevamento di aneuploidie in tutti i cromosomi. Abbiamo applicato questo nuovo approccio cromosomica in uno studio CWA dei lavoratori cinesi benzene esposti 8,10.
Protocol
Discussion
Questo romanzo OctoChrome-FISH test permette di esaminare contemporaneamente tutti i 24 cromosomi umani in una ibridazione solo su una diapositiva. La disposizione delle combinazioni cromosomiche sugli 8 quadrati è stato progettato per facilitare l'identificazione delle non-casuali riarrangiamenti cromosomici nei più comuni leucemie e linfomi. Così, il saggio può rilevare numerico (aneuploidia) nonché strutturali (traslocazioni) alterazioni cromosomiche contemporaneamente.
La fase p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Cliona M. McHale per criticamente la lettura e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health concessione R01ES017452 a L Zhang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd, Cambridge, UK | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen Corporation | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen Corporation | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S., Barch, M. J. . In The ACT cytogenetics laboratory. , 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
