Summary
رواية مضان
Abstract
مضان في تهجين موضعية (سمكة) هي تقنية تسمح ليتم الكشف عن تسلسل الحمض النووي محددة على الكروموسومات الطورية أو الطور البيني في نوى الخلايا 1. هذه التقنية يستخدم الحمض النووي تحقيقات مع تسلسل فريد من نوعه لهجن الكروموسومات كله أو مناطق معينة الكروموسومات، وبمثابة مساعدا قويا لعلم الوراثة الخلوية الكلاسيكية. على سبيل المثال، ذكرت في وقت سابق العديد من الدراسات للكشف الانحرافات المتكررة للكروموسوم زيادة في المرضى بسرطان الدم وبين التعرض للبنزين، والمرضى البنزين للتسمم، والعاملين في مجال صحي يتعرضون لمادة البنزين، وذلك باستخدام التحليل الوراثي الخلوي الكلاسيكية 2. استخدام الأسماك، وقد لوحظت اللوكيميا محددة التعديلات الكروموسومات إلى أن تكون مرتفعة في اصحاء العمال المعرضين لمادة البنزين 3-6، مما يشير إلى الأدوار الحاسمة من التغييرات cytogentic في البنزين التي يسببها leukemogenesis.
بشكل عام، وهو فحص سمكة واحدة يدرس فقط واحد أو عدد قليل الكروموسومات كاملأو مواضع معينة لكل شريحة، حتى التهجين متعددة تحتاج إلى أن تتم على عدة شرائح لتغطية كل من الكروموسومات البشرية. karyotyping الطيفية (السماء) ويسمح التصور من الجينوم كله في وقت واحد، ولكن شرط لبرنامج خاص وحدود معدات تطبيقه 7. هنا، نحن تصف رواية فحص الأسماك، OctoChrome للأسماك، والتي يمكن تطبيقها لChromosomics، التي نحدد هنا كما في التحليل المتزامن لجميع الكروموسومات 24 الإنسان على شريحة واحدة في الدراسات الإنسانية، مثل عدم توازن الصبغيات دراسة كروموسوم واسعة (CWAS) 8. وبناء على طريقة، وتسويقها بواسطة Cytocell كما Chromoprobe نظام Multiprobe، هو جهاز OctoChrome الذي ينقسم إلى 8 مربعات، كل منها يحمل ثلاثة مختلفة اللوحة كروموسوم كامل تحقيقات (الشكل 1). وصفت مباشرة كل من تحقيقات مع 3 fluorophore بلون مختلف، والأخضر (FITC)، الحمراء (تكساس الأحمر)، والأزرق (الكومارين). ترتيب مجموعات كروموسوم على OctoChromوقد تم تصميم الجهاز الإلكتروني لتسهيل التعرف على التعديلات غير عشوائية كروموسوم الهيكلية (translocations) وجدت في سرطانات الدم الأكثر شيوعا واللمفومات، لتي سبيل المثال (9، 22)، تي (15، 17)، تي (8 و 21 )، تي (14 و 18) 9. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن التغييرات العددية (عدم توازن الصبغيات) في الصبغيات (الكروموسومات) في وقت واحد. وينقسم أيضا الشريحة قالب المقابلة إلى 8 مربعات على الذي لا بد ينتشر الطورية (الشكل 2)، ويتم وضعه على جهاز OctoChrome. تحقيقات والحمض النووي المستهدفة هي التشويه والتحريف في درجة حرارة عالية والمهجنة في غرفة رطبة، وبعد ذلك كل الكروموسومات 24 الإنسان يمكن تصور في وقت واحد.
FISH OctoChrome هي تقنية واعدة للتشخيص السريري لسرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية وللكشف عن [أنيوبلويدي] في جميع الكروموسومات. وقد طبقنا هذا النهج الجديد Chromosomic في دراسة CWAS من البنزين المعرضة للعمال الصينيين 8،10.
Protocol
1. نموذج إعداد الشرائح
- تم تصميم FISH OctoChrome لدراسة التغيرات الكروموسومية في هوامش الطورية من الخلايا البشرية، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر مثقف الخلايا الدموية المحيطية، والخلايا الجذعية / السلف، وخطوط الخلية. وينبغي إعداد العينات بعد أن الإجراء المعتاد لحصاد metaphases 3،11-13: عن طريق استخدام العلاج colcemid للقبض على خلايا في الطورية، علاج تضخم منخفض التوتر على الخلايا، وCarnoy ومثبت لإصلاح الخلايا في التعليق على ما يقرب من 0،5-1 X الخلايا 6 10 لكل مل.
- تنظيف الشريحة 8 مربع (المنصوص عليها في عدة OctoChrome، كتالوج #: PMP 803، Cytocell المحدودة، كامبريدج، المملكة المتحدة، الشكل 2) عن طريق غمس إلى الإيثانول النقي لمدة 2 دقيقة.
- قبل اتخاذ الشريحة عينة، وانخفاض كمية صغيرة من الخلايا على شريحة لفحص كثافة الخلية. إذا كانت كثافة الخلية مرتفعة جدا (عدد كبير جدا من الخلايا المتداخلة)، يخفف من التعليق مع مثبت الطازجة. إذا كانت كثافة منخفضة جدا الخلية (خلية قليلة جداق على الشريحة)، وتدور باستمرار في الخلايا وأصغر حجم مثبت الطازجة إعادة تعليق. ماصة ميكرولتر 5-10 من التعليق على كل خلية من 8 مناطق من الشريحة قالب في سلسلة من المربعات بالتناوب 1/7 - 2 / 8-3 / 5 - 4/6. مرة الاولى مربعين والمجفف في الهواء، بقعة الساحات المتبقية بنفس الطريقة. وهذا يمنع انتشار الخلايا من التداخل مع بعضها البعض.
- ويمكن تخزين الشريحة المجففة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في جو النيتروجين لأكثر من 5 سنوات قبل التهجين.
2. توطين metaphases باستخدام نظام آلي
- تطبيق 20 ميكرولتر من 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (0.2 ميكروغرام / مل) إلى مركز كل نصف الشريحة ومن ثم تغطية مع ساترة.
- إجراء الفحص الآلي للشريحة عينة في توطين الخلايا الطورية باستخدام Metafer البرمجيات (MetaSystems، Altlussheim، ألمانيا). هذا يسهل موقع metaphases جميع والمستقبل إعادة تقييم جميع الصور الخلية.
- عرض نتائج المسح يدويا وحذف غير الطورية التحف.
3. تهجين
- إعداد الشريحة عينة وجهاز OctoChrome
- تراجع الشريحة عينة في محكمة أمن الدولة العازلة 2X في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ليغسل دابي.
- يذوى الشريحة عينة من خلال سلسلة من يغسل الإيثانول (2 دقيقة في كل من 70٪، 85٪ والايثانول 100٪)، والسماح ليجف ووضعه على 37 درجة مئوية موقد لمدة 5 دقائق.
- وضع التهجين Multiprobe غرفة Chromoprobe (المنصوص عليها في عدة OctoChrome) في حمام ماء C ° 37، والسماح للتوازن إلى 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية).
- مزيج من حل التهجين (المنصوص عليها في عدة OctoChrome) بواسطة pipetting المتكررة وقبل دافئ 1 قسامة 25 ميكرولتر لكل جهاز OctoChrome إلى 37 درجة مئوية.
- قبل دافئ كل جهاز OctoChrome (المنصوص عليها في عدة OctoChrome، انظر الشكل 2) إلى 37 درجة مئوية عن طريق وضع الجانب تسمية جهاز حفر على موقد. لا تلمس رانه السطوح تنقش الجهاز OctoChrome لأنها تحتوي على تحقيقات.
- تحديد المواقع من الشريحة عينة على جهاز OctoChrome (الشكل 2)
- إضافة 2 ميكرولتر من حل تهجين ما قبل حرارة على كل من المجالات الثمانية على الجهاز قبل حرارة OctoChrome في حين لا يزال عند 37 درجة مئوية.
- بعناية عكس الشريحة قالب على جهاز OctoChrome مثل الموجود الرقم 1، والذي هو الآن رأسا على عقب، فوق منطقة اليد اليمنى العليا للجهاز OctoChrome. للمساعدة في تحديد مربع 1، اتسم موقفها على الجهاز في أورانج.
- تأكد من أن يتم محاذاة بعناية الشريحة قالب مع مجالات مطابقة على الجهاز OctoChrome. خفض بعناية الشريحة على جهاز OctoChrome بحيث قطرات من محلول التهجين اجراء اتصالات مع الشريحة. تطبيق لطيف، والضغط حتى لضمان أن يتم نشر حل التهجين على حواف كل مجال من المجالات المطروحة على الجهاز OctoChrome.
- رفعالشريحة / OctoChrome، وعقد بعناية نهاية متجمد من شريحة زجاجية، وعكس ذلك أن الشريحة هي تحت الجهاز OctoChrome. تأكد من أن الجهاز لا تشهير عبر الشريحة قالب مثل هذا يمكن أن تسبب انتقال التلوث من التحقيقات.
- مكان على 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) موقد لمدة 10 دقائق.
- تمسخ
- نقل الجهاز الشريحة / OctoChrome عينة لموقد رعاية خاصة من أجل الاحتفاظ بها مستوى. ضمان الشريحة عينة الاتصالات بالتساوي على موقد.
- تفسد على موقد عند 75 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- تهجين
- مكان الشريحة عينة / جهاز OctoChrome في التهجين غرفة Chromoprobe Multiprobe.
- استبدال غطاء وتطفو على غرفة في 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) حمام الماء (غير - التحريك) بين عشية وضحاها. يرجى ملاحظة: لا اغلاق الغطاء على غرفة تهجين، لا ختم غطاء على حمام مائي، لا هجن فيالحاضنة. هذه الخطوات حاسمة لضبط نسبة الرطوبة.
- بعد تهجين يغسل
- تحضير محاليل غسيل
الحل 1: إعداد جرة Coplin / Hellendahl تحتوي على 0.4x محكمة أمن الدولة. تتوازن إلى 72 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.0.
حل 2: إعداد جرة Coplin / Hellendahl 2X تحتوي على محكمة أمن الدولة و0.05٪ توين 20. السماح للوقوف على درجة حرارة الغرفة. - إزالة الجهاز OctoChrome بعناية من الشريحة ووضع الشريحة في الحل 1 لمدة 2 دقيقة.
- وضع الانزلاق نحو الحل 2 لمدة 30 ثانية.
4. تصاعد والتصور لنتائج
- تطبيق 20 ميكرولتر من دابي إلى مركز كل نصف الشريحة وتطبيق ساترة.
- احتضان في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل عرض بواسطة الفحص المجهري مضان.
5. ممثل النتائج
فيقوإعادة 3A يظهر خلية الطورية طبيعي في ساحة 2. (1) - (3): رسمت الكروموسومات 8، 21 و 12 الأحمر والأخضر والأزرق، ونحن من خلال تصور الأحمر تكساس، FITC، ومرشح DEAC، على التوالي، (4): التصور من خلال دابي / FITC / تكساس الأحمر الثلاثي مرشح. عموما، فإن الكروموسومات رسمت باللون الأزرق ليست واضحة من خلال الفلتر الثلاثي وتحتاج إلى أن ينظر إليها في إطار تصفية DEAC محددة.
ويبين الشكل 3B الخلايا الشاذة مع ممثل اللوكيميا محددة إزفاء الكروموسومات وعدم توازن الصبغيات. (1): تي (8، 21)، وإزفاء مشترك الكروموسومات في سرطان الدم النخاعي الحاد، (2): تثلث الصبغي 21، ثلاث نسخ من كروموسوم 21، وعدم توازن الصبغيات شيوعا في الإصابة بسرطان الدم.
الشكل 1. ترتيب مجموعات كروموسوم على الجهاز OctoChrome والنتائج المتوقعة لوحة الكروموسومات.
الشكل 2. وضعية شريحة عينة على جهاز OctoChrome.
الشكل 3. النتائج الممثلالتي تم الحصول عليها من الأسماك OctoChrome (مربع 2).
3A الشكل. خلية طبيعية مع الصبغيات (الكروموسومات) 8، 12، 21 رسمت في ساحة 2.
3B شخصية. الخلايا الشاذة مع الممثل اللوكيميا محددة إزفاء الكروموسومات وعدم توازن الصبغيات في ساحة 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الرواية OctoChrome الأسماك فحص يسمح احد لفحص في وقت واحد كل 24 الكروموسومات البشرية في تهجين واحدة على شريحة واحدة. وقد تم تصميم هذا الترتيب من تركيبات كروموسوم على المربعات 8 إلى تسهيل التعرف على إعادة ترتيب الكروموسومات غير عشوائية في سرطانات الدم الأكثر شيوعا والليمفوما. وبالتالي، يمكن للفحص كشف العددية (عدم توازن الصبغيات)، فضلا عن التعديلات الهيكلية كروموسوم (translocations) في وقت واحد.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا الاختبار هو السيطرة على نسبة الرطوبة خلال التهجين بين عشية وضحاها في الغرفة العائمة في حمام ماء. تحقيقات السمكية، وعازلة تهجين تجف بسهولة ما إذا كانت الرطوبة منخفضة، أو أصبح تمييع للغاية عن طريق امتصاص الرطوبة أكثر من اللازم إذا كانت الرطوبة عالية. ويمكن إما نتيجة التأثير سلبيا على النتائج. وهناك تعديل ممكن للتغلب على هذا التحدي هو لاغلاق جهاز OctoChrome وشريحة عينة مع الشريط وهجن على درجة 37؛ C موقد في ليلة وضحاها الظلام.
قد شرائح العينة التي تم سن الكثير من أن تكون غير صالحة للاستخدام في هذا الاختبار مباشرة. بينما هضم مثل هذه العينات مع البيبسين من شأنها تحسين تهجين، وتخزين الشرائح عينة المعدة في جو من النيتروجين عند درجة حرارة -20 ° C ينصح بشدة لتقليل الشيخوخة.
OctoChrome الأسماك هي تقنية واعدة للتشخيص السريري لسرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية. كما أنها مفيدة جدا لدراسة إعادة ترتيب الكروموسومات معظم محددة تتعلق اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية البشرية في السكان المعرضين لleukemogens المحتملة وlymphomagens ودراسة آثار عدم توازن الصبغيات الذي يحفز من المواد الكيميائية بطريقة كروموسوم واسع. دراستنا CWAS السابقة باستخدام هذه التقنية أثبتت أن بعض الكروموسومات قد يكون أكثر تضررا من غيرها عن طريق التعرض لمادة البنزين 8،10، وهي مادة كيميائية الأولية الصناعية والملوثات البيئية في كل مكان أن يسبب سرطان الدم البشري 14.ويمكن استكشاف هذه الظاهرة من "عدم توازن الصبغيات الانتقائية" في التعرض للمواد الكيميائية الأخرى التي تستعمل CWAS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور محمد Cliona مكهيل لقراءة ناقدة وتحرير المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، المعهد الوطني للصحة منح R01ES017452 لتشانغ L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
