Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test
Summary
Een nieuwe fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH) methode die gelijktijdig onderzoekt zowel numerieke en structurele chromosoom veranderingen, name de specifieke chromosomale translocaties geassocieerd met leukemie en lymfoom, van alle 24 menselijke chromosomen op een enkel apparaat in een hybridisatie wordt beschreven.
Abstract
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die het mogelijk maakt specifieke DNA-sequenties kunnen worden opgespoord op metafase of interfase chromosomen in celkernen 1. De techniek maakt gebruik van DNA-probes met unieke sequenties die hybridiseren met hele chromosomen of specifieke chromosomale regio's, en dient als een krachtige aanvulling op de klassieke cytogenetica. Bijvoorbeeld, veel eerdere studies meldde de frequente detectie van verhoogde chromosoomafwijkingen bij leukemie patiënten die verband houden met blootstelling aan benzeen, benzeen-vergiftiging patiënten en gezonde werknemers die worden blootgesteld aan benzeen, met behulp van klassieke cytogenetische analyse 2. Met behulp van FISH, hebben leukemie-specifieke chromosomale veranderingen waargenomen te worden verhoogd in ogenschijnlijk gezonde werknemers blootgesteld aan benzeen 3-6, met vermelding van de kritische rol van cytogentic veranderingen in benzeen geïnduceerde leukemie.
Over het algemeen, een enkele FISH-test onderzoekt slechts een of een paar hele chromosomenof specifieke loci per dia, zodat meerdere kruisingen te worden uitgevoerd op meerdere dia's om alle menselijke chromosomen te dekken. Spectral karyotypering (SKY) maakt visualisatie van het hele genoom tegelijkertijd, maar de eis van speciale software en apparatuur beperkt de toepassing ervan 7. We beschrijven hier een nieuwe FISH-test, OctoChrome-vis, die kan worden toegepast voor Chromosomics, die we hier definiëren als de gelijktijdige analyse van alle 24 menselijke chromosomen op een dia in humane studies, zoals chromosoom-brede aneuploïdie studie (CWA's) 8. De basis van de methode, markt gebracht door Cytocell als de Chromoprobe Multiprobe System, is een OctoChrome apparaat dat verdeeld in 8 vierkanten, die elk draagt drie verschillende heel chromosoom painting probes (Figuur 1). Elk van de drie probes rechtstreeks gelabeld met een verschillende gekleurde fluorofoor, groen (FITC), rood (Texas Red) en blauw (Cumarine). De opstelling van chromosoom combinaties op de OctoChrome toestel is ontworpen om de identificatie van de non-random structurele chromosoombeschadiging veranderingen (translocaties) gevonden in de meest voorkomende leukemieën en lymfomen vergemakkelijken, bijvoorbeeld t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Bovendien kan numerieke veranderingen (aneuploïdie) in chromosomen gelijktijdig worden gedetecteerd. De overeenkomstige template objectglaasje wordt ook verdeeld in 8 vierkanten waarop de metafase spreads gebonden zijn (figuur 2), en zich boven de OctoChrome apparaat. De probes en target DNA zijn gedenatureerd bij hoge-temperatuur en gehybridiseerd in een vochtige kamer, en vervolgens alle 24 menselijke chromosomen kunnen gelijktijdig gevisualiseerd.
OctoChrome FISH is een veelbelovende techniek voor de klinische diagnose van leukemie en lymfoom en voor de detectie van aneuploïdieën in alle chromosomen. We hebben toegepast deze nieuwe Chromosomic aanpak in een CWA's studie van benzeen blootgestelde Chinese arbeiders 8,10.
Protocol
Discussion
Deze roman OctoChrome-FISH-test maakt het mogelijk om tegelijkertijd alle 24 menselijke chromosomen te onderzoeken in een hybridisatie op een dia. De opstelling van chromosoom combinaties op de 8 pleinen is ontworpen om de identificatie van de non-random chromosoomherschikkingen in de meest voorkomende leukemieën en lymfomen vergemakkelijken. Zo kan de test gelijktijdig detecteren numerieke (aneuploidie) als structureel (translocaties) chromosoom veranderingen.
De meest kritische stap in di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Cliona M. McHale bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health subsidie R01ES017452 naar L Zhang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd, Cambridge, UK | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen Corporation | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen Corporation | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S., Barch, M. J. . In The ACT cytogenetics laboratory. , 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
