Summary
이 비디오 프로토콜은 neurosphere 분석 문화 방법을 사용하여 수술 resected 인간 glioblastoma의 mutliforme (GBM) 종양 조직에서 세포처럼 고립과 줄기의 확장을 보여줍니다.
Abstract
줄기 세포와 같은 그러한 유방, 폐, 결장, 전립선과 두뇌와 같은 종양에 고립되어있다. 이러한 모든 종양에서 중요한 문제는, 특히 glioblastoma의 mutliforme (GBM)에, 종양 형성, 진행 및 재발 그들의 역할을 조사하기 위해 종양 시작 세포 인구 (들)을 식별하고 격리하는 것입니다. 세포 인구를 시작 이해 종양이 종양에 대한 효과적인 치료 방법을 찾는 데 실마리를 제공할 것입니다. 의 단순 성과 재현성으로 인해 neurosphere 분석 (NSA)이 종양 세포의 많은 고립과 전파에 대한 선택의 방법으로 사용되고 있습니다. 이 프로토콜은 수술 resected 인간 GBM 종양 조직에서 줄기 같은 세포를 분리하고 확장 neurosphere 문화 방법을 보여줍니다. 절차는 초기 화학 소화 및 종양 조직의 기계적 분리, 그리고 이후 NSA 문화에서 발생한 단일 세포 현탁액을 도금이 포함됩니다. 150-2의 7~10일 후, 기본 neurospheres직경 00 μm의 준수 더욱 passaging 및 확장을위한 준비가되어 있습니다.
Protocol
1. 기본 GBM 조직의 수집
- glioblastoma mutliforme (GBM) 종양은 암 진단과 수술을받은 환자로부터 얻은 것입니다.
- 준비는 신경 외과 팀하셔야합니다. 신경 외과는 신경 줄기 세포 (NSC) 10-15%의 항생제 (Peniciline / Streptomycine)와 보충 기저 매체를 포함하는 적절한 크기의 튜브에 resected의 GBM 종양 추가됩니다. 차가운 매체 실험실로 수술실에 제공해야합니다. 또는 감기에 HEPES - 버퍼 최소 필수 배지 (앙) 또는 인산염은 항생제의 높은 농도와 염분 (PBS)는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다 버퍼.
- resected 종양 조직은 얼음에있는 실험실로 전달, 그리고 후드를 배치됩니다.
2. 단일 셀 서스펜션에 차 종양의 분해
- 원래 중간 / PBS를 초과은 팔콘 튜브에서 제거되고 샘플 5-10m로 2-3 번 씻어입니다PBS / NSC 기저 매체의 전 혈액과 이물질을 제거합니다. PBS / 매체가 제거되고 GBM 종양 조직은 배양 접시에 배치됩니다.
- 조직은 작은 조각으로 잘라 trypsinization 프로세스의 면적을 증가 작은 조각에 번호 10 메스 블레이드와 다진 있습니다. 닦지는 종양의 크기에 따라 1~3분 소요될 수 있습니다.
- 다진 조직은 사전 예열 % 0.05 37 ° C의 물을 욕조에 10-15분에 대한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 - 5ml에 trypsinized 있습니다. 전자 피펫은 15ml 팔콘 튜브에 작은 종양의 조각과 트립신를 전송하는 데 사용됩니다.
- 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨은 잠복기 후 효소 트립신의 반응을 중지에 추가됩니다.
- 트립신의는 불활 성화를 여러 번 다운 서스펜션을 pipetting과에 의해 보장됩니다. 그런 다음 중지를위한 5 분 800rpm (110g)에 centrifuging에 의해 아래 pelleted 있습니다.
- 뜨는가 삭제되고 조직 조각은 무균 NSC 바의 1ml에 resuspended 아르샐 매체. 대단히 짧은 부드럽게 부드러운 하얀 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 (3-7 회) 위아래 pipetting 및하여 dissociated 수 있습니다. pipetting 단계의 수는 직접 다진 조직의 입자의 크기에 따라 달라집니다. 그것이 세포 죽음과 구체 형성의 감소가 발생 하듯이 장기와 활발한 기계적 분리는 피해야한다.
- 취소 dissociated 조각과 파편을 제거하려면, 기저 매체 10-15 ML은 튜브에 추가되고 세포 현탁액은 50ml 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 필터링됩니다.
- 필터링 정지 5 분에 대한 800rpm (110g)에 centrifuged입니다. 뜨는는 나중에 삭제됩니다.
- Pelletted 전지는 다음 셀 카운트를위한 완벽한 NSC 매체의 1 2ml에 resuspended 있습니다.
3. 셀 카운트 및 도금
- 세포 현탁액의 10 μL은 1ml eppendorf 튜브에 0.04 % Trypan 블루 90 μL에 추가됩니다.
참고 : 다른 적절한 세포를 거치도록tions도 사용할 수 있습니다. - 정지를 섞어 아래 피펫합니다. 세포 / trypan 파랑 혼합 10 μL은 세포 밀도를 계산하기 위해 hemocytometer로 전송됩니다.
- 세포의 0.2 % 헤파린 (2μg/ml)의 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF와 1μl/ml와 보충 완료 NSC 매체 (9시 1분 비율 NSC 기저 매체와 NSC 확산 보완의 혼합물)에 도금 아르 적절한 조직 문화 선박. 중간의 5, 20, 40 ML는 각각, T25, T80과 T175 flasks에 사용됩니다. 항생제는 오염의 기회를 감소 1:100의 농도에서 매체에 추가할 수 있습니다.
- 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2 배양기 세트에 배치됩니다.
4. Passaging와 GBM 파생 분야의 확장 :
- neurospheres 직경 150-200 μm의의 평균 크기에 도달하면 문화 subculture 준비가되었습니다. 각 플라스크의 내용은 적절한 크기의 살균 tiss에서 제거 및 위치UE 문화 튜브, 그리고 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged.
- 뜨는이 제거되고 펠렛은 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 최적의 trypsinization을 달성하기 위해, 세포 현탁액은 37 ° C 2-3 분 물 목욕에 incubated입니다. 트립신 활동을 중지하려면 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨 세포 현탁액에 추가되고 세포 현탁액은 부드럽게 위아래로 pipetted하고 있습니다.
- 세포 현탁액은 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 NSC 매체의 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 앞에서 설명한대로 셀 개수가 수행됩니다.
- 세포는 성장 인자와 같은 이전 부분에 설명된 적절한 크기의 조직 문화 선박의 도금과 보충 완료 NSC 매체에 5x10 4 셀 / ML의 농도에 도금하고 있습니다.
- 습기에 ° C 37 incubated 때 보조 neurospheres는 70~10일에 형성5% CO 2 ified 인큐베이터.
5. 대표 결과 :
GBM 종양 조직에서 수확한 단일 세포를 도금 후, 종양 줄기와 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식과 (비디오와 그림 1 참조) 3-4일에 몇 가지 세포로 구성된 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 이러한 클러스터의 성장에 따라, 그들은 150-200 마이크론 양식 (비디오 및 그림 2 참조)의 평균 직경 7~8일하여 수 있도록 좀 더 원형 모양, 적절한 단계 밝은 분야를 취득. 높은 배율에서 건강 분야는 일반적으로 자신의 주변에서 microspikes를 보여줍니다. 문화 개시는 문화의 binging에 비 dissociated 대단히 짧은 시간의 존재로 인해 진정한 분야로 착각해서는 안됩니다 이후 1~2일의 클러스터와 같은 큰 범위를 가졌어요. 기본 종양 영역의 문화에 파편의 양은 조직의 초기 소스에 따라 다릅니다 그리고 그것은 모든 주위의 뇌 조직을 포함할지 여부. 적절한 조직 준비 기법매체의 충분한 양의 효소와 기계적 분리, 그리고 샘플의 후속 필터를 포함하는 것은 문화에 덜 파편이 발생할 수 있습니다.
그림 1. 사일 도금 후에 기본 GBM의 구체 문화. 종양 줄기 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 3~4일에서 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 원본 확대, 20x.
그림 2. 팔일 도금 후 항로 일 GBM의 영역 문화를. 원본 확대, 20x.
Discussion
신경 줄기 및 일반 성인과 태아의 뇌 1, 2, 3, 4에서 전구 세포를 분리하고 줄기는 같은 같은 폐 5, 전립선 6, 유방 7 뇌 8, 9로 암 조직에서 세포 neurosphere 분석은 또한 종양되었습니다 자주 선택의 방법으로 사용됩니다. 전직 생체내의 multipotency, 주입시 새로운 종양을 만들 수있는 능력, 그리고 자기 갱신,이 간단하고 재현성 분석을 사용하여 하나는 체세포 줄기 세포와 유사한 특성을 보여주 resected 종양 조직에서 세포의 무기한 번호를 생성할 수 있습니다. 이러한 전지는 휴대 전화의 상호 작용, 그리고 차별화, 마이 그 레이션, 침략과 세포 사망을 포함하여 기본적인 암 세포 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 절연 종양 줄기 세포와 같은 방법은 종양의 형태, 진행 및 재발 또한 공부 결국에는 건강에 대한 인사이트를 제공할 수있는 기본 파생 세포 메커니즘을 해명하는 소중한 도구를 제공합니다옵션을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
뇌종양 치료에 대한 프레스톤 A. 웰스 주니어 센터,이 작품은 뇌 종양 연구 플로리다 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
