Isolasjon og utvidelse av Human glioblastoma multiforme kreftceller Bruke Neurosphere Assay

Summary

Denne videoen protokoll demonstrerer isolasjon og utvidelse av stamceller som celler fra kirurgisk resected human glioblastoma mutliforme (GBM) svulstvev bruker neurosphere analysen kulturen metoden.

Abstract

Stem-lignende celler har vært isolert i svulster som bryst, lunge, tykktarm, prostata og hjerne. Et kritisk problem i alle disse svulstene, spesielt i glioblastom mutliforme (GBM), er å identifisere og isolere tumor initiere celle befolkning (r) for å undersøke deres rolle i tumordannelse, progresjon, og gjentakelse. Forstå tumor initiere celle populasjoner vil gi ledetråder for å finne effektive terapeutiske tilnærminger for disse svulstene. Den neurosphere analysen (NSA) på grunn av sin enkelhet og reproduserbarhet har vært brukt som metode for valg for isolasjon og spredning av mange av denne kreftceller. Denne protokollen demonstrerer neurosphere kultur metoden for å isolere og utvide stilk-lignende celler i kirurgisk resected human GBM svulstvev. Prosedyrene har en innledende kjemisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon av svulstvev, og senere plating den resulterende eneste celle suspensjon i NSA kultur. Etter 7-10 dager, primære neurospheres av 150-200 mikrometer i diameter kan observeres og er klar for videre passaging og ekspansjon.

Protocol

1. Innsamling av Primary GBM Tissue

1. En glioblastoma mutliforme (GBM) svulst er hentet fra en pasient diagnostisert med kreft og gjennomgår kirurgi.
2. Ordninger må gjøres med nevrokirurgi team. Nevrokirurgen vil plassere resected GBM svulst i en passende størrelse tube inneholder nevrale stamceller (NSC) basal medium supplert med 10-15% antibiotika (Peniciline / Streptomycine). Cold medium må gis til operasjonssalen av lab. Alternativt kald HEPES-bufret minimum viktig medium (HEM) eller fosfatbufret saltløsning (PBS) med høy konsentrasjon av antibiotika kan også brukes til dette formålet.
3. Den resected svulstvev leveres til laboratoriet på is og plassert under panseret.

2. Dissosiasjon av primærtumor i Single-Cell Suspension

1. Overskudd av den opprinnelige medium / PBS er fjernet fra falk tube og prøven er vasket 2-3 ganger med 5-10ml av PBS / NSC basal medium for å fjerne blod og rusk. Den PBS / Medium er fjernet og GBM svulstvev er plassert i en petriskål.
2. Vevet er skåret i små biter og hakket med en nr. 10 skalpell blad i små biter for å øke arealet for trypsinization prosess. Hakking kan ta 1-3 minutter avhengig av størrelsen på svulsten.
3. Den hakket vevet er trypsinized i 3-5ml av forvarmet% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minutter på et 37 ° C vannbad. En elektronisk pipette brukes til å overføre den lille svulst stykker og trypsin i en 15ml Falcon tube.
4. En tilsvarende volum av soyabønner trypsin inhibitor er lagt for å stoppe den enzymatiske trypsin reaksjon etter inkubasjonstiden.
5. Trypsin inaktivering sikres ved pipettering suspensjonen opp og ned flere ganger. Deretter er det fjæringen pelleterte nede ved sentrifugering på 800 omdr. (110g) for 5min.
6. Supernatanten er forkastet og vevet bitene er resuspendert i 1 ml sterile NSC basal medium. Den klumper er dissosiert ved forsiktig pipettering opp og ned (3-7 ganger) til en glatt melkeaktig enkelt celle suspensjon er oppnådd. Antallet pipettering steg avhenger direkte av størrelsen på partiklene i finhakket vev. Langvarig og kraftig mekanisk dissosiasjon bør unngås da det kan resultere i celledød og en reduksjon i sfære formasjon.
7. Slik fjerner un-dissosiert biter og rusk, er 10-15 ml basal medium lagt til røret og cellesuspensjonen er filtrert gjennom en 40 micron celle sil i en 50ml tube.
8. Den filtrerte Fjæringen er sentrifugeres ved 800 omdr. (110g) for 5min. Supernatanten forkastes etterpå.
9. Pelletted cellene blir deretter resuspendert i 1-2 ml av komplette NSC medium for celle teller.

3. Celletall og Plettering

1. 10 mL av cellen suspensjon er lagt til 90 mL av 0,04% Trypan blå i en 1 ml Eppendorf rør.
   Merknad: annet passende celle dilusjoner kan også brukes.
2. Pipetter opp og ned for å blande suspensjonen. 10 mL av celler / trypan blå blandingen er overført til hemocytometer for å telle celle tetthet.
3. Cellene er belagt i fullstendig NSC medium (en blanding av NSC basal medium og NSC spredning supplement til en 9:01 ratio) supplert med 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF og 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i passende vev kultur fartøy. 5, 20 og 40 ml medium brukes for T25, T80 og T175 kolber, henholdsvis. Antibiotika kan legges til mediet på en konsentrasjon av 1:100 for å redusere sjansen for forurensning.
4. Flasken er plassert i en inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO _2.

Fire. Passaging og utvidelse av GBM avledet sfærer:

1. Når neurospheres nådd en gjennomsnittlig størrelse på 150-200 mikrometer i diameter, er kulturen klar for subkultur. Innholdet i hver kolbe er fjernet og plassert i en passende størrelse steril Tissue kultur tube, og sentrifugeres på 800 rpm (110 g) i 5 min ved romtemperatur.
2. Supernatanten fjernes og pelleten er resuspendert i 1 ml av% 0,05 trypsin-EDTA.
3. For å oppnå en optimal trypsinization er cellesuspensjonen inkubert ved 37 ° C i vannbad i 2-3 min. For å stoppe trypsin aktiviteten et likt volum av soyabønner trypsin inhibitor er lagt til cellesuspensjonen og cellesuspensjonen er forsiktig pipetteres opp og ned.
4. Cellen Fjæringen er sentrifugeres ved 800 rpm (110g) i 5 min. Deretter er supernatanten fjernes og cellene er resuspendert i 1 ml av NSC medium.
5. En celle teller er utført som beskrevet tidligere.
6. Cellene er belagt i en konsentrasjon på 5x10 ⁴ celler / ml i fullstendig NSC medium supplert med vekstfaktorer og belagt i passende størrelse vevskultur fartøy som beskrevet i forrige del.
7. Sekundære neurospheres dannes i 7-10 dager da inkubert ved 37 ° C i en fuktigifisert kuvøse med 5% CO _2.

5. Representant Resultater:

Etter plating av enkeltceller høstet fra GBM svulstvev, tumor stilk-lignende celler spre seg og generere små klynger av celler består av få celler i 3-4 dager (se video og Figur 1). Som disse klyngene vokse, få de en mer sfærisk form, slik at ved 7-8 dager, riktig fase lyse kuler med en gjennomsnittlig diameter på 150-200 mikrometer form (Se video og Figur 2). Ved høyere forstørrelse, sunn sfærer vanligvis demonstrere microspikes i periferien deres. Å ha store området som klynger på 1-2 dager etter kultur innvielsen skyldes eksistensen av ikke-dissosiert klumper på binging av kultur og bør ikke forveksles som sant sfærer. Mengden av vrakgods i primærtumor sfære kultur varierer avhengig av den opprinnelige kilden til vev og hvorvidt den inkluderer noen omkringliggende hjernevev. Riktig vev forberedelse teknikkerinkludert enzymatiske og mekanisk dissosiasjon, og etterfølgende filtrering av prøven med tilstrekkelig mengde medium kan resultere i mindre rusk i kultur.

Figur 1. Primær GBM sfære kultur 4 dager etter plating. Tumor stilk-lignende celler spre seg og generere små klynger av celler i 3-4 dager. Original Forstørrelse: 20x.

Figur 2. Passage en GBM sfære kultur 8 dager etter plating. Original Forstørrelse: 20x.

Discussion

Å isolere nevrale stamceller og stamceller fra normal voksen og fosterets hjerne ^{1, 2, 3, 4} og også tumor stilk-lignende celler fra cancer vev som ^fem lunge-, ^prostata-6, bryst ⁷ og ^{8 hjerne, 9} den neurosphere analysen har vært hyppig brukt som metode for valg. Ved hjelp av denne enkle og reproduserbare analysen, kan man generere et ubestemt antall celler fra resected svulstvev som viser lignende egenskaper som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til å skape nye svulster etter implantasjon, og selvfornyelse. Disse cellene kan brukes til å studere grunnleggende kreft cellebiologi inkludert celle-til-celle interaksjoner, og differensiering, migrasjon, invasjon og celledød. I tillegg isolerte tumor stilk-lignende celler gir et uvurderlig verktøy for å studere hvordan svulster form, fremdrift, og tilbakefall og også å avdekke de underliggende deriving cellulære mekanismene som til slutt kunne gi innsikt til terapeutiskalternativer.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche Group	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD Biosciences	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Biosciences	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.