Summary
Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te volgen
Abstract
Graft-versus-host disease (GVHD) de beperkende belemmering voor het brede gebruik van beenmergtransplantatie als therapie voor verschillende hematologische tekortkomingen. GVHD wordt veroorzaakt door volwassen alloreactieve T-cellen in het beenmerg transplantaat die worden ingebracht in de ontvanger en schade aan organen gastheer. Echter in muizen T-cellen moeten worden toegevoegd aan het beenmerg inoculum aan GvHD. Hoewel er veel werk verricht om T cel responsen na transplantatie karakteriseren bioluminescent belichtingstechniek is een niet-invasieve methode om T cel handel patronen te meten in vivo.
Na dodelijke bestraling, zijn ontvangende muizen getransplanteerd met beenmerg cellen en splenocyten van donor muizen. T-cel subsets van L2G85.B6 (transgene muizen die constitutief luciferase) zijn in het transplantaat. Door alleen transplanteren bepaalde T-cel subsets, men in staat om specifieke T cel subsets in vivo volgen,en op basis van hun locatie, het ontwikkelen van hypothesen over de rol van specifieke T-cel subsets in het bevorderen van GVHD op verschillende tijdstippen. Op vooraf bepaalde tijdstippen na transplantatie, ontvangende muizen afgebeeld met een Xenogen IVIS CCD camera. De lichtintensiteit kan worden gekwantificeerd met behulp van levende beeld software om een pseudo-kleurenbeeld op basis van foton-intensiteit (rood = hoge intensiteit, violet = lage intensiteit) te genereren.
Tussen 4-7 dagen na de transplantatie, ontvangende muizen beginnen om de klinische symptomen van GVHD vertonen. Cooke et al. 1. Ontwikkelde een scoringssysteem tot ziekteprogressie basis van de ontvangende muizen vacht textuur, integriteit van de huid activiteit, gewichtsverlies, en houding kwantificeren. Muizen worden dagelijks gescoord, en gedood wanneer ze ten dode opgeschreven. Ontvangende muizen worden over het algemeen ten dode opgeschreven 20-30 dagen na de transplantatie.
Muismodellen zijn waardevolle instrumenten voor het bestuderen van de immunologie van GVHD. Selectief transplanteren het bijzonder T-cel subsets al.dieptepunten voor zorgvuldige identificatie van de rollen elke subset speelt. Niet-invasieve volgen van T cel responsen in vivo werkt als een extra waarde murine GVHD modellen.
Protocol
1. Lethal Bestraling
- Plaats maximaal 10 ontvangende muizen in een kooi microisolator verenigbaar met de bestraler te gebruiken.
- Bestralen in 2 gelijke doses opsomming totale dosis (totale dosis = 9 cGy voor BALB.B ontvangers). Tweede doorstraling 3 uur na eerste. Injectie moet plaatsvinden tussen 4-6 uur na de laatste bestraling. Bestralen in muizen ofwel Cs 137 bron en RS2 000, bestraler.
- Na de tweede stralingsdosis store muizen in microisolator kooien met aangezuurd water tot het tijdstip van transplantatie.
2. Splenocyten Voorbereiding
- Euthanaseren een donor muis volgens de institutionele richtlijnen. Elke donor levert over het algemeen 75x10 6 - 125x10 6 splenocyten. Met CD8 zuivering kits, levert elke muis algemeen 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T cellen.
- Verwijder de milt door eerst een verticale insnijding 2 cm 2 cm rechts van de middellijn rechtstreeksonder de ribbenkast. Knip de vacht, huid en viscerale membraan.
- Verwijder milt en met enkelvoudige celsuspensie door het plaatsen milt in 40 ul mesh scherm in een petrischaal met RPMI 1640 met 5% FBS. Gebruik een zuiger van de spuit te breken behalve de milt totdat de gehele milt is gepasseerd mesh scherm.
- Herhaal dit proces voor elke WT en L2G85.B6 donor. Verzamel alle WT enkele cel suspensies in 1 tot 50 ml conische buis, en het verzamelen van alle L2G85.B6 enkele cel suspensies in een aparte 50 ml conische buis.
- Centrifugeer cellen bij 1200 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Resuspendeer pellets in RPMI 1640 met 5% FBS en count cellen.
3. Bone Marrow Voorbereiding
- Verwijder het vel van een achterpoot onderdeel van een donor muis.
- Voorzichtig weggesneden zo veel spierweefsel mogelijk van femur en de tibia / fibula.
- Verwijder de achterste ledematen door het snijden van femur weg bij het heupgewricht. Weggesneden achter poot net onder tibia / fibula kruising. Alle botten bezuinigingen moeten worden uitgevoerd met stevige schaar.
- Verwijder voorzichtig het resterende spierweefsel. Snijd fibula-relatief weinig beenmerg wordt gevonden in kuitbeen en niet de moeite waard.
- Plaats achterste ledematen in koud RPMI 1640 5% FBS en herhaal het proces met de tweede achterste ledematen. Elke muis moet opleveren tussen 20x10 6 - 40x10 6 beenmergcellen.
4. Bone Marrow verwijderen
- Verwijder een achterpoot van media en in grote petrischaal met een kleine hoeveelheid koude media (~ 1 ml).
- Knip het kniegewricht. Met behulp van een injectiespuit (volume> 5 ml), insert subcutane naald in het scheenbeen en druk spuit totdat alle rode materiaal wordt verwijderd uit het interieur van de tibia. Herhaal de procedure met dijbeen. Gooi overgebleven botten ontdaan van het beenmerg. Herhaal de procedure met de tweede achterste ledematen.
- Met enkelvoudige celsuspensie door het pipetteren van medium met beenmerg in grote petrischaal en het gebruik zuiger en 40 plmesh scherm. Pipet enkele celsuspensie in 50 ml conische buis en op ijs bewaren.
5. CD3 Uitputting
Er zijn verschillende manieren om CD3 + cellen van het beenmerg afbreken. Ons laboratorium gebruikt een kit door Miltenyi Biotec (CD3-biotine - 130-093-021). Afbrekende CD3 + cellen van het beenmerg volgens het protocol van de fabrikant. De buffer voor Miltenyi kits voortaan genoemd MACS buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in PBS, pH 7,2).
- Was de cellen door centrifugeren splenocyten en beenmergcellen bij 1200 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C en aantal cellen.
- Verwijder ALLE supernatant. Resuspendeer beenmergcellen in 100 ul per 10 miljoen beenmergcellen in MACS buffer.
- Ga verder met CD3 uitputting gebruik produceert 'protocol.
- Was CD3 verarmd beenmergcellen 3 keer in steriele PBS. Aantal CD3 uitgeputte beenmergcellen en resuspendeer in een geschikt volume 10 7 cellen injecteren.
Er zijn verschillende manieren om CD8 T-cellen te zuiveren van L2G85.B6 muizen. Ook zijn er verschillende manieren om CD8 T cel depletie van WT splenocyten donors. Ons laboratorium maakt gebruik van kits van Miltenyi Biotec (CD8 uitputting - 130-049-401, CD8 zuivering - 130-095-236).
- Resuspendeer de WT pellet in 90 ul MACS buffer per 10 7 cellen. Ga verder met CD8 T-cel depletie volgens produceert 'protocol (CD8 uitputting - 130-049-401).
- Resuspendeer de L2G85.B6 pellet in 40 ul MACS buffer per 10 7 cellen. Ga verder met CD8 T-cel zuivering volgens produceert 'protocol (CD8 zuivering - 130-095-236).
- Tel elke celpopulatie en was elke populatie 3 maal met steriele PBS. Resuspendeer elke populatie in de juiste hoeveelheid op 18x10 6 WT (CD8 verarmd) splenocyten en 2x10 6 L2G85.B6 gezuiverd CD8 T-cellen te injecteren.
7. Injectiepreparaat
- Combineer 10 7 CD3 uitgeputte beenmergcellen, 18x10 6 WT (CD8 verarmd) splenocyten en 2x10 6 L2G85.B6 gezuiverde CD8 T cellen in een microcentrifugebuis. Wassen met steriele PBS en resuspendeer in 300 ul.
- Injecteer celpreparaat in de staartader van ontvangende muizen. Injecties moeten worden gedaan met behulp van 28 gauge naalden.
- Bewaren muizen in microisolator kooi met aangezuurd water. Score muizen dagelijks gebruik scoresysteem GVHD scoresysteem ontwikkeld door Cooke et al. 1.
8. Bioluminescent Imaging
- Zes dagen na de transplantatie, injecteren ontvangende muizen met 4 mg D-luciferine. Toestaan 5 min voor luciferine te reageren met luciferase.
- Verdoof muis in isofluraan kamer van bioluminescentie imager en beeld ontvangers voor 5 min met kleine binning. Dit zal leiden tot een hoge resolutie afbeelding, terwijl het verzamelen van zo veel evenementen mogelijk te maken.
- Analyseer gegevens met behulp van LivingBeeld software. De omvang van de pseudo-color beeld kan worden veranderd om de beste resultaten. Het is echter noodzakelijk dat dezelfde schaal worden gebruikt in experimenten.
- Regio's van belang kan worden gemaakt met behulp van Living Image software en licht emittance kunnen worden gekwantificeerd door het berekenen van de flux (fotonen / sec) wordt uitgezonden door elk gebied van belang.
9. Representatieve resultaten
Ongeveer 7-10 dagen na de transplantatie, muizen beginnen met klinische symptomen van GVHD. Muizen lijken smerig door gebrek aan verzorging. Ontvangers zal ook beginnen om gewicht te verliezen tussen de 7-10 dagen na de transplantatie. Activiteit en houding van de ontvangende muizen zullen relatief normaal blijven tot ongeveer dag 12 tot 14 na de transplantatie. Cumulatieve GVHD scores zal gestaag toenemen door de eerste 2-3 weken na de transplantatie (Figuur 1A). Ziekteverloop is zeer variabel tussen muizen, maar de ontvangers moeten uniform bezwijken voor GVHD met 30-40 degen na transplantatie (Figuur 1B).
Figuur 2 ontvangende muizen die zijn afgebeeld 6 dagen na transplantatie. Pseudo-gekleurde schaal toont wisselende licht emittance door het lichaam met de hoogste lichtintensiteit wordt uitgezonden in de milt en de darmen. CD8 T cel accumulatie in de darm is consistent met eerdere bevindingen 6. Ontvangende muizen kunnen worden geplaatst in microisolator kooi af te beelden op een later tijdstip of gedood voor ex vivo imaging.
| Criteria | Graad 0 | Graad 1 | Grade 2 |
| Gewichtsverlies (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Houding | Normaal | Hunching alleen in rust | Verschillende hunching; schaadt VERKEERnt |
| Activiteit | Normaal | Milde tot afname van de activiteit matige | Stationaire tenzij gestimuleerd |
| Textuur van de vacht | Normaal | Lichte tot matige ruffling | Ernstige roffelende / slechte verzorging |
| Huidstructuur | Normaal | Het schalen van poten / staart | Voor de hand liggende gebieden van de open huid |
Tabel 1. Cooke et al. ontwikkelde dit scoresysteem in 1996 1. Muizen moet dagelijks worden gescoord op elk van de criteria aan de linkerkant. Elke muis krijgt een score van 0-2 voor elk criterium en de totale score is de som van alle individuele scores.
Figuur 1. Lethaal bestraalde BALB.B werden getransplanteerd met 10 7 botbeenmergcellen alleen of met 18x10 6 CD8 T cellen ontdane WT splenocyten en 2x10 6 gezuiverd L2G85.B6 CD8 T-cellen. A) klinische score gegevens van de ontvangers van beenmerg alleen of met CD8 T cel depletie WT splenocyten en gezuiverd L2G85.B6 CD8 T-cellen. B) Survival gegevens van de ontvangers van beenmerg alleen of met CD8 T cel depletie WT splenocyten en gezuiverd L2G85.B6 CD8 T-cellen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Lethaal bestraalde BALB.B muizen getransplanteerd met 10 7 beenmergcellen alleen of met 18x10 6 CD8 T cellen ontdane WT splenocyten en 2x10 6 gezuiverd L2G85.B6 CD8 T-cellen. Ontvangers werden geïnjecteerd met 4 mg D-luciferine via intraperitoneale injectie en werden afgebeeld met Xenogen IVIS 5 min bij kleine binning. Pseudo-gekleurde beelden worden getoond waar paars staat voor lage intensiteit en rood staat voor hoge intensiteit Regio's van belang werden getekend rond de gehele muis en de totale flux (fotonen / sec) werden gekwantificeerd.
Figuur 3. Lethaal bestraalde BALB.B muizen getransplanteerd met 10 7 beenmergcellen alleen of met 18x10 6 CD8 T cellen ontdane WT splenocyten en 2x10 6 gezuiverd L2G85.B6 CD8 T-cellen. Ontvangers werden geïnjecteerd met 4 mg D-luciferine via intraperitoneale injectie en werden afgebeeld met Xenogen IVIS 5 min bij kleine binning. Pseudo-gekleurde beelden worden getoond waar paars staat voor lage intensiteit en rood staat voor een hoge intensiteit. Ontvangers werden afgebeeld op A) dag 4, B) dag 6, en C) dag 8 na de overdracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol voor het induceren van GVHD in muizen hier voorgesteld is een klinisch relevant model van murine GVHD. Oorspronkelijk opgericht door Berger et al.. In 1994, de C57Bl / 6 in BALB.B stam combinatie is MHC-afgestemd, met GVHD sterfte gemedieerd door CD4 afhankelijk, CD8 T effectoren 2, zeer vergelijkbaar met de meest voorkomende klinische scenario 3. Het is bekend dat transplantatie CD8 T cellen alleen geen GvHD in dit model, maar de ziekte is aanzienlijk slechter wanneer zowel CD4 en CD8 T cellen aanwezig zijn in vergelijking met CD4 T-cellen alleen. Bovendien is er veel werk met de immunodominante hiërarchie van de immuunrespons op minor histocompatibility verschillen in dit model 10. Er blijft enige onduidelijkheid over de rol voor T-cel subsets gedurende verschillende fasen van GVHD 4. Niet-gepubliceerde studies in ons laboratorium suggereren dat CD4 T-cellen een dominante rol spelen tijdens de vroege GVHDgebeurtenissen, terwijl CD8 T cellen overheersen op latere tijdstippen.
De mogelijkheid om T-cel accumulatie patronen te volgen in vivo is een krachtig hulpmiddel dat het potentieel heeft om hypothesen met betrekking tot CD4 en CD8 T-cel bijdragen tijdens GVHD te testen heeft. Muizen transgene voor vuurvlieg luciferase werden in eerste instantie ontwikkeld in het laboratorium van dr. Robert Negrin 5. Vanwege hun constitutieve luciferase expressie, kunnen cellen van deze muizen donor worden bijgehouden in vivo in een niet-invasieve techniek 5. Een ander voordeel van dit model is dat individuele muizen kunnen worden gevolgd in de tijd. Echter, ondanks herhaalde beeldvorming van ontvangende muizen, blijft er experimentele variabiliteit tussen ontvangers. Zoals getoond in figuur 2, het gebied van het gehele lichaam flux is 2,4 miljoen en het de muis met de laagste flux minder dan 60% van de totale flux lichaam van de muis met de grootste flux. Omdat een luciferase transgen geschikt voor Tcell detectie kan de luciferase positieve stam gemakkelijk worden gekweekt om dubbel transgene muizen te creëren. Studies in ons laboratorium hebben aangetoond een rol voor het integrine CD103 de bevordering GVHD 6. CD103 is een integrine expressie op CD8 T cellen 7 en het ligand E-cadherine, die selectief is uitgedrukt op epitheelcellen 8,9. Het creëren van een CD103-/ - muis die in staat is om uit te drukken luciferase zal zorgen voor experimenten verder hypothesen over de rol van CD103 in GVHD te testen. Deze experimentele techniek beperkt de evaluatie accumulatie patronen tussen organen. Alternatieve technieken moeten worden gebruikt om cellulaire mensenhandel patronen toe te lichten binnen de individuele organen. Het koppelen van een klinisch relevante GVHD model met bioluminescente beeldvorming zal helpen licht werpen op de kinetiek van T-cel mensenhandel en relatieve bijdragen van CD4 en CD8 T-cellen na beenmergtransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dank verschuldigd aan Alice Gaughan en Jiao-Jing Wang waarvan de uitstekende technische ondersteuning, intellectuele inbreng, en morele steun waren instrumentaal in het verplaatsen van deze studies vooruit. Deze studies werden ondersteund door de NIH subsidie AI036532 te GAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
