Summary
손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는 능력
Abstract
그라프 트 - 대 - 호스트 질환 (GVHD)는 hematological 결함의 다양한 치료 요법으로 골수 이식의 광범위한 사용에 제한 장벽입니다. GVHD는받는 사람에 주입하는 골수 이식에 존재하는 성숙 alloreactive T 세포에 의한와 호스트 장기에 손상을 일으킬 수 있습니다. 그러나 마우스에서 T 세포는 GVHD 원인 골수 inoculum에 추가해야합니다. 광범위한 작업은 T 세포 응답 포스트 이식을 특성화하기 위해 수행되었지만, 발광 생물 이미징 기술은 생체에서 T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는 비 침습적 방법입니다.
치명적인 조사 후,받는 사람 쥐들이 기증 마우스의 골수 세포와 splenocytes으로 이식되어 있습니다. L2G85.B6 (constitutively 루시 페라 제 표현 형질 전환 생쥐)에서 T 세포의 하위 집합은 이식에 포함되어 있습니다. 특정 T 세포 하위 집합을 이식함으로써, 하나는 생체에서 특정 T 세포 하위 집합을 추적 할 수 있습니다과 위치에 따라 다양한 시간 지점에서 GVHD 홍보에서 특정 T 세포 하위 집합의 역할에 관한 가설을 개발합니다. 미리 결정된 간격 게시물 이식에서받는 마우스는 Xenogen IVIS CCD 카메라를 사용하여 이미징 있습니다. 빛의 세기가 광자 강도 (빨간색 = 높은 강도, 보라색 = 낮은 강도)을 기반으로 한 의사 컬러 이미지를 생성하는 생활 이미지 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수 있습니다.
4-7일 게시물 이식 사이에받는 마우스는 GVHD의 임상 징후를 보여 시작합니다. 쿡 외. 1받는 사람 쥐 모피 텍스처, 피부 무결성, 활동, 체중 감소 및 자세에 따라 질병의 진행을 quantitate 할 수있는 점수 시스템을 개발했습니다. 마우스는 매일 채점, 그리고 그들이 죽어가는이 될 때 euthanized 있습니다. 받는 마우스는 일반적으로 20-30일 게시물 이식 죽어가는이됩니다.
손쥐 모델은 GVHD의 면역학을 공부를위한 유용한 도구입니다. 선택적으로 특정 T 세포 하위 집합 알을 이식각 하위 집합이 재생 역할에주의 식별 낮은. 비 invasively 생체에서 T 세포 응답을 추적하는 것은 손쥐 GVHD 모델에 가치의 또 다른 레이어를 추가합니다.
Protocol
1. 치명적인 조사
- 사용되는 irradiator와 호환 microisolator 케이지에 10받는 마우스까지 넣습니다.
- 총 복용량을 (BALB.B 수신자에 대한 총 투여 량 = 9 cGy)의 합계가 2 회에 걸쳐 동일한 비추다. 두 번째 조사는 먼저 한 후 3 시간이어야합니다. 사출 최종 조사 후 4-6 시간 사이에 발생합니다. C를 137 소스 나 RS2, 000, irradiator 하나를 비추다 마우스.
- 이식 때까지 산성화 물과 microisolator 케이지에서 두 번째로 방사선 선량, 상점 쥐를 따라.
2. Splenocyte 준비
- 기관 지침에 따라 한 기증자 마우스를 안락사시켜야. 125x10 6 splenocytes - 각 기증자는 일반적으로 75x10 6 산출. 12x10 6 CD8 T 세포 - CD8 정화 키트를 사용하여 각 마우스는 일반적으로 6x10 6 산출.
- 첫번째 오른쪽 바로 중간 선에 수직 2cm 절개 2cm을 만들어 비장을 제거흉곽 아래에. 모피, 피부와 내장의 막으로 자른다.
- 비장을 제거 5 % FBS와 1640 RPMI로는 배양 접시에 40 μl 메쉬 화면에서 비장을 배치하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 전체 비장이 메쉬 화면 통과 될 때까지 비장을 분리 부술 수있는 주사기 플런저를 사용하십시오.
- 각 WT와 L2G85.B6 기증자에 대해이 과정을 반복합니다. 1-50 ML 원뿔 튜브에있는 모든 WT 단세포 정지를 수집하고, 별도의 50 ML 원뿔 튜브에있는 모든 L2G85.B6 단세포 정지를 수집합니다.
- 4에 10 분에 1,200 rpm으로 세포를 원심 분리기 ° C. 5% FBS와 카운트 세포와 1,640 RPMI에 Resuspend 펠릿.
3. 골수 준비
- 기증자 마우스 중 하나 뒷다리에서 피부를 제거합니다.
- 대퇴골과 경골주의 / 비골에서 가능한 한 많은 근육 조직으로 떼어.
- 엉덩이 관절에서 떨어져 대퇴골을 절단하여 뒷다리를 제거합니다. 단 경골 / 비골 교차로 아래 뒤쪽 손을 떼어. 모든 뼈 인하는 튼튼한 가위를 사용하여야한다.
- 주의 깊게 남아있는 근육 조직을 제거합니다. 비골 - 비교적 적은 골수가 비골에서 발견하고 노력을 가치가되지 않습니다 잘라.
- 두 번째 뒷다리와 추위 1,640 RPMI 5퍼센트 FBS를 반복 과정에서 뒷다리를 배치합니다. 40x10 6 골수 세포 - 각각의 마우스는 20x10 6 시까 얻을 수 있습니다.
4. 골수 제거
- 추운 미디어 (~ 1 ML)의 적은 양으로 큰 배양 접시에있는 미디어 및 장소에서 한 뒷다리를 제거합니다.
- 무릎 관절을 떼어. 경골에 주사기 (볼륨> 5 ML), 삽입 피하 바늘을 사용하여 모든 빨간색 자료는 경골의 내부에서 제거 될 때까지 주사기를 놓으면 되죠. 대퇴골과 과정을 반복합니다. 골수이없는 나머지 뼈를 폐기하십시오. 둘째 뒷다리와 과정을 반복합니다.
- 대형 페트리 접시 및 사용 주사기 플런저와 μl 40로 골수를 포함하는 pipetting 미디어에 의해 단일 세포 현탁액을 만듭니다화면을 조화. 피펫 단세포 50 ML 원뿔 튜브에 서스펜션과 얼음 계속.
5. 3 번 CD 고갈
골수에서 3 번 CD + 세포를 고갈하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 우리 연구실은 Miltenyi Biotec (- 130-093-021에는 3 번 CD-비오틴)에서 만든 키트를 사용합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 골수에서 3 번 CD + 세포를 고갈시킵니다. Miltenyi 키트에 대한 버퍼는 지금의 맥 버퍼 (2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), PBS, pH를 7.2에서 0.5 % BSA)라고합니다.
- 4에 10 분 ° C 및 count 세포에 1,200 rpm으로 splenocytes 및 골수 세포를 centrifuging하여 세포를 씻으십시오.
- 모든 표면에 뜨는을 제거합니다. Resuspend 골수 맥 버퍼 1 천만 골수 세포 당 100 μl의 세포.
- 사용에는 3 번 CD 고갈로 계속은 '프로토콜을 생산하고 있습니다.
- 멸균 PBS로 3 번 CD 소모의 골수 세포에게 3 번 씻으십시오. 카운트 3 번 CD는 골수 세포를 고갈과 10 7 세포를 삽입 할 수있는 적절한 볼륨에 resuspend.
L2G85.B6 마우스에서 CD8 T 세포를 정화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 또한, WT splenocyte 기증자에서 CD8 T 세포를 고갈하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 우리 연구실은 Miltenyi Biotec (- 130-049-401, CD8 정화 - 130-095-236 CD8 고갈)에서 키트를 사용합니다.
- 10 7 세포 당 90 μl 맥 버퍼에 WT 펠렛을 Resuspend. '프로토콜 (- 130-049-401 CD8 고갈) 제조에 따라 CD8 T 세포 고갈를 계속합니다.
- 10 7 세포 당 40 μl 맥 버퍼에 L2G85.B6 펠렛을 Resuspend. '프로토콜 (- 130-095-236 CD8 정화) 제조에 따라 CD8 T 세포 정화를 계속합니다.
- 각 셀 인구를 산출하고 멸균 PBS 각 인구에게 3 번 씻는다. 18x10 6 WT (CD8 소모) splenocytes 및 2x10 6 CD8 T 세포를 정화 L2G85.B6를 삽입하기 위해 적절한 볼륨에있는 각 인구 Resuspend.
7. 사출 준비
- microcentrifuge 관에서 CD8 T 세포를 정화 10 7 3 번 CD 고갈 골수 세포, 18x10 6 WT (CD8 소모) splenocytes, 그리고 2x10 6 L2G85.B6 조화를 이루고 있습니다. 300 μl에 멸균 PBS와 resuspend로 씻으십시오.
- 받는 마우스의 꼬리 정맥에 셀 준비를 삽입. 주사는 28 게이지 바늘을 사용하여 수행해야합니다.
- 산성화의 물 microisolator 케이지에 저장 마우스. 점수 마우스는 매일 쿡 외 1 개발 점수 GVHD 점수 시스템을 사용합니다.
8. 발광 생물 이미징
- 여섯 일 후 이식, 4 MG D-luciferin을받는 쥐를 주입. luciferin 5 분 루시 페라 제와 반응 할 수 있습니다.
- 작은 binning 5 분 동안 bioluminescence의 영상 및 이미지 수신자의 isoflurane 챔버에 마우스를 마취. 가능한 한 많은 이벤트로 수집하는 동안이 고해상도 이미지를 생성합니다.
- 생활을 사용하여 데이터를 분석이미지 소프트웨어. 의사 색 이미지의 규모는 최상의 결과를 얻을 수 있도록 변경 될 수 있습니다. 그러나, 같은 규모의이 실험에서 사용하는 것이 필수적입니다.
- 관심 영역은 관심의 각 지역에서 방출되는 자속을 (광자 / 초) 계산하여 정량화 할 수 있습니다 생활 이미지 소프트웨어 및 조명 emittance를 사용하여 생성 할 수 있습니다.
9. 대표 결과
약 7-10일 게시물 이식, 쥐 GVHD의 임상 징후를 보여주는 시작합니다. 마우스 미용 부족으로 단 정치 못한 인해 나타납니다. 수신자는 7~10일 게시물 이식 사이에 체중을 잃게됩니다. 받는 마우스의 활동과 자세는 약 12-14 일 후 이식까지 비교적 정상으로 유지됩니다. 누적 GVHD 점수는 꾸준히 최초의 2-3주 게시물 이식 (그림 1A)를 통해 증가 할 것이다. 질병 과정은 마우스 사이에 매우 변수입니다하지만, 수신자가 균일 30-40 D에 의해 GVHD에 굴복해야합니다ays 후 이식 (그림 1B).
그림 2는 6 일 후 이식을 이미지로 된받는 사람 쥐를 보여줍니다. 의사 색의 규모는 비장과 창자에서 방출되는 높은 광도로 몸 가벼운 emittance를 변화 보여줍니다. 속에서 CD8 T 세포의 축적은 이전 연구 결과 6 일치합니다. 받는 마우스는 이후 시점에서 이미징 또는 전직 생체 이미징에 대한 euthanized 할 microisolator 케이지에 다시 배치 할 수 있습니다.
| 기준 | 등급 0 | 1 학년 | 2 급 |
| 체중 감량 (wkly.) | <10 % | > 10 % - <25 % | > 25% |
| 자세 | 표준 | 나머지에서만 Hunching | 여러 hunching, impairs movemeNT |
| 활동 | 표준 | 활동 감소를 운영 마일드 | 자극하지 않는 고정 |
| 모피 텍스처 | 표준 | ruffling 검토 할 온화한 | 심한 ruffling / 가난한 정리 |
| 피부 질감 | 표준 | 손 / 꼬리 크기 조정 | denuded 피부의 명백한 지역 |
표 1. 쿡 외 1996 1이 점수 시스템을 개발했습니다. 마우스는 왼쪽에있는 기준의 각에서 매일 골을해야합니다. 각 마우스는 각 기준에 대해 0-2의 점수를 부여하고 총 점수는 모든 개별 점수의 합입니다.
그림 1. Lethally 방사능 BALB.B은 10 7 뼈 이식되었습니다골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6. A) 골수을받는 임상 점수 데이터를 단독으로 또는 CD8 T 세포와 WT splenocytes을 소진하고 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화. B) 골수을받는 단독으로 또는 함께의 서바이벌 데이터 CD8 T 세포 WT splenocytes을 소진하고 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. Lethally 방사능 BALB.B 마우스는 10 7 골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6으로 이식되었다. 받는 사람이 intraperitoneal 주사를 통해 4 MG D-luciferin을 주입 한 작은 binning에서 5 분 동안 Xenogen의 IVIS를 사용하여 이미징했다. PS보라색은 낮은 강도를 나타냅니다, 붉은 관심의 높은 강도 지역별은 전체 마우스와 총 자속 (광자 / 초) 주변에 그려진 된 정량화 된 나타냅니다 eudo 색의 이미지가 표시됩니다.
그림 3. Lethally 방사능 BALB.B 마우스는 10 7 골수 세포 단독으로 또는 L2G85.B6 CD8 T 세포를 정화 18x10 6 CD8 T 세포 고갈 WT splenocytes 및 2x10 6으로 이식되었다. 받는 사람이 intraperitoneal 주사를 통해 4 MG D-luciferin을 주입 한 작은 binning에서 5 분 동안 Xenogen의 IVIS를 사용하여 이미징했다. 보라색은 낮은 강도를 나타냅니다과 빨간색이 높은 강도를 나타냅니다 의사 색 이미지가 표시됩니다. 받는 사람이 A) 4 일, B) 일 6, C) 일 8 포스트 송금 이미징했다.
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Discussion
여기에 제시된 마우스에 GVHD 유도를위한 프로토콜은 손쥐 GVHD의 임상 관련 모델을 나타냅니다. 원래 버거 외에 의해 설립. 1994 년 BALB.B 변형 조합에 C57Bl / 6 의존 CD4, 가장 일반적인 임상 시나리오 3 매우 유사한 CD8 T의 effectors 2에 의해 중재 GVHD 사망률과 MHC-일치합니다.이 그것은 혼자 CD8 T 세포를 이식하면이 모델 GVHD 발생하지 않습니다 알려져 있지만, 질병의 진행은 혼자 CD4 T 세포에 비해 CD4와 CD8 T 세포가 모두 존재하는 경우 훨씬 더 있습니다. 또한,이 모델 10 부 histocompatibility의 불균형에 대한 면역 반응의 immunodominant 계층 구조를 보여주는 다양한 작품이있었습니다. 하지만, GVHD 4 가지 단계 중에 T 세포 하위 집합에 대한 역할에 관한 몇 가지 모호가 남아 있습니다. 저희 연구실에서 게시되지 않은 연구는 CD4 T 세포가 일찍 GVHD 동안 지배적 인 역할을하는 것이 좋습니다이벤트, CD8 T 세포는 나중에 지점에서 지배하면서.
생체에 T-세포 축적 패턴을 추적 할 수있는 능력은 CD4와 CD8 T GVHD 동안 셀 기부에 대한 가설을 테스트 할 수있는 가능성이있는 강력한 도구입니다. 반딧불 루시 페라 제를위한 마우스 유전자 변형은 처음 박사 로버트 Negrin (5)의 연구실에서 개발되었습니다. 때문에 자신의 제정 루시 페라 제 표현의 이러한 기증자 마우스의 세포는 비 침습적 영상 기술 5를 사용 생체에서 추적 할 수 있습니다. 이 모델의 또 다른 장점은 각각의 마우스가 시간이 지남에 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 그러나,받는 마우스의 반복 영상에도 불구하고, 수신자 사이의 실험 다양성이 유지됩니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 총 몸 유량의 범위는 2,400,000이며, 가장 낮은 자속와 마우스가 가장 큰 자속과 마우스보다 토탈 바디 유량 미만 60 % 있습니다. 하나의 루시 페라 제 transgene은 TC에 적합하기 때문에예쁜 검출는, 루시 페라 긍정적 인 변형이 쉽게 두 유전자 변형 쥐를 만들어 사육 할 수 있습니다. 우리 연구실에서 연구 GVHD 6 증진에 인테그린 CD103의 역할을 보여 주었다. CD103 선택적으로 상피 세포 8,9에 표시됩니다 CD8 T 세포 7 리간드가 E-cadherin이며,에 표현 인테그린입니다. 루시 페라 제는 GVHD의 CD103의 역할에 대한 자세한 가설을 테스트하는 실험 수 표현 할 수있는 마우스 - CD103-/ 만들기. 이 실험 기법은 장기 사이에 축적 패턴을 평가로 제한됩니다. 다른 기술은 개별 기관에서 세포의 거래 패턴을 명료하게하다하기 위해 이용해야합니다. 발광 생물 이미징과 임상 관련 GVHD 모델을 결합하여 T 세포의 인신 매매 및 골수 이식 후 CD4와 CD8 T 세포의 상대적인 기여의 동력학에 창고 빛을 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 그의 뛰어난 기술 지원, 지적 입력 및 정신적 지원 앞서 연구를 이동하는 역할을했다 앨리스 고간과 자오 - 징 왕에게 빚을 졌네. 이러한 연구 GAH에 NIH 보조금 AI036532에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
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