Summary
Murine benmargstransplantasjon er en mye brukt teknikk for å studere immunologiske mekanismer som styrer graft-versus-host sykdom hos mennesker. Muligheten til å overvåke T celle trafficking mønstre
Abstract
Transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD) er den begrensende barriere til allsidig bruk av benmargstransplantasjon som kurativ terapi for en rekke hematologiske mangler. GVHD er forårsaket av modne alloreactive T-celler til stede i benmargen pode som er tilført i mottakeren og skade vert organer. Men i mus, må T-celler legges til benmargen inokulatet å føre GVHD. Selv om omfattende arbeid har blitt gjort for å karakterisere T celle responser etter transplantasjon, er bioluminescent bildeteknologi en ikke-invasiv metode for å overvåke T celle trafficking mønstre in vivo.
Etter dødelig bestråling, er mottaker mus transplantert med benmargceller og splenocyttene fra donor mus. T celle undergrupper fra L2G85.B6 (transgene mus som konstitutivt uttrykker luciferase) er inkludert i transplantasjon. Ved kun transplantere visse T-celle-undergrupper, er man i stand til å spore spesifikke T celle undergrupper in vivo,og basert på deres sted, utvikle hypoteser for den rolle spesifikke T celle undergrupper i fremme GVHD ved forskjellige tidspunkter. På forhåndsbestemte intervaller etter transplantasjon, er mottaker mus avbildes ved hjelp av en Xenogen IVIS CCD-kamera. Lysintensiteten kan kvantifiseres ved hjelp levende bilde programvare for å generere en pseudo-fargebilde basert på foton intensitet (rød = høy intensitet, fiolett = lav intensitet).
Mellom 4-7 dager etter transplantasjon, mottaker mus begynner å vise kliniske tegn på GVHD. Cooke et al. 1 utviklet et poengsystem for å kvantifisere sykdomsprogresjon basert på mottakeren mus pels tekstur, hud integritet, aktivitet, vekttap, og holdning. Mus scoret daglig, og avlives når de blir døende. Mottaker mus generelt blitt døende 20-30 dager etter transplantasjon.
Murine modeller er verdifulle verktøy for å studere immunologi GVHD. Selektivt transplantere bestemt T-celle undergrupper allows for forsiktig identifisering av rollene hver undergruppe spiller. Non-invasiv sporing T celle responser in vivo legger et lag av verdi til murine GVHD modeller.
Protocol
1. Dødelig bestråling
- Plasser opptil 10 mottaker mus inn en microisolator bur forenlig med irradiator skal brukes.
- Irradiate i to like doser summere total dose (total dose = 9 CGY for BALB.B mottakere). Andre bestråling bør være 3 timer etter første. Injeksjon bør skje mellom 4-6 timer etter siste bestråling. Strålebehandling mus i enten Cs 137 kilde eller RS2, 000, irradiator.
- Etter de andre stråledosegrenser, lagre mus i microisolator bur med forsurede vann inntil tidspunktet for transplantasjon.
2. Splenocyte Forberedelse
- Avlive en donor mus i henhold til institusjonelle retningslinjer. Hver donor gir generelt 75x10 6 - 125x10 6 splenocyttene. Bruke CD8 rensing kits, gir hver mus generelt 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T-celler.
- Fjerne milten ved først å lage en vertikal 2 cm snittet 2 cm til høyre for midtlinjen direkteunder brystkassen. Skjære gjennom pelsen, hud og visceral membran.
- Fjern milt og lage enkelt cellesuspensjon ved å plassere milt i 40 pl mesh sikt i en petriskål med 1640 RPMI med 5% FBS. Bruk en sprøytestempelet for å bryte fra hverandre milten inntil hele milten er ført gjennom mesh sikt.
- Gjenta denne prosessen for hver WT og L2G85.B6 donor. Samle alle WT encellete suspensjoner i 1-50 ml konisk tube, og samle alle de L2G85.B6 encellete suspensjoner i en egen 50 ml konisk tube.
- Sentrifuger cellene ved 1200 rpm i 10 min ved 4 ° C. Resuspender pellets i 1640 RPMI med 5% FBS og telle celler.
3. Bone Marrow Forberedelse
- Fjern skinnet fra en hind lem av en donor mus.
- Klipp forsiktig bort så mye muskelvev som mulig fra femur og tibia / fibula.
- Fjern hind lem ved å kutte femur bort på hofteleddet. Skjær bort bakre pote rett under tibia / fibula skjæringspunktet. Alle beininnsnitt bør gjøres ved hjelp av solid saks.
- Forsiktig fjerne eventuelle gjenværende muskelvev. Avskåret fibula-relativt lite benmarg er funnet i fibula og ikke verdt innsatsen.
- Plasser hind lem i kaldt 1640 RPMI 5% FBS og gjenta prosessen med den andre hind lem. Hver mus bør gi mellom 20x10 6 - 40x10 6 benmargceller.
4. Bone Marrow fjerning
- Fjerne en hind lem fra media og legg i store petriskål med en liten mengde av kalde medier (~ 1 ml).
- Skjær bort kneleddet. Ved hjelp av en sprøyte (volum> 5 ml), innsatsen subkutan nål i tibia og trykke sprøyten inntil alle røde materiale er fjernet fra innsiden av tibia. Gjenta prosessen med femur. Kast gjenværende bein blottet for benmarg. Gjenta prosessen med andre hind lem.
- Lag enkelt celle suspensjon av pipetteringsutstyr medier som inneholder benmarg i stor petriskål og bruk sprøytestempelet og 40 plmesh sikt. Pipette enkel cellesuspensjon i 50 ml konisk rør og holde på is.
5. CD3 Nedbryting
Det finnes en rekke måter å utarme CD3 + celler fra benmargen. Vår lab bruker et kit laget av Miltenyi Biotec (CD3-biotin - 130-093-021). Utarme CD3 + celler fra benmargen etter produsentens protokoll. Bufferen for Miltenyi kits vil heretter bli kalt MACS-buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA i PBS, pH 7,2).
- Vask cellene ved sentrifugering splenocyttene og benmargsceller ved 1200 opm i 10 minutter ved 4 ° C og telle celler.
- Fjern alle supernatant. Resuspender benmargceller i 100 ul per 10 millioner benmargsceller i MACS Buffer.
- Fortsett med CD3 uttømming hjelp produserer 'protokoll.
- Vask CD3 utarmet benmargceller 3 ganger i sterilt PBS. Count CD3 utarmet benmargsceller og resuspender i et passende volum til å injisere 10 7 celler.
Det finnes en rekke måter å rense CD8 T-celler fra L2G85.B6 mus. Også, det er flere måter å utarme CD8 T-celler fra WT splenocyte givere. Vår lab bruker kits fra Miltenyi Biotec (CD8 uttømming - 130-049-401, CD8 rensing - 130-095-236).
- Resuspender WT pellet i 90 ul MACS Buffer per 10 7 celler. Fortsett med CD8 T-celle uttømming ifølge produserer 'protokoll (CD8 uttømming - 130-049-401).
- Resuspender L2G85.B6 pellet i 40 pl MACS Buffer per 10 7 celler. Fortsett med CD8 T-celle rensing i henhold til produserer 'protokoll (CD8 rensing - 130-095-236).
- Telle hver celle populasjon og vaske hver populasjon 3 ganger med sterilt PBS. Resuspender hver populasjon i riktig volum å injisere 18x10 6 WT (CD8 utarmet) splenocyttene og 2x10 6 L2G85.B6 renset CD8 T-celler.
7. Injeksjon Forberedelse
- Kombiner 10 7 CD3 utarmet benmargceller, 18x10 6 WT (CD8 utarmet) splenocyttene og 2x10 6 L2G85.B6 renset CD8 T-celler i en mikrosentrifugerør. Vask med sterilt PBS og resuspender i 300 ul.
- Injisere celleforberedelsen inn halevenen mottakerland mus. Injeksjoner bør gjøres ved hjelp av 28 måle nåler.
- Oppbevar mus i microisolator bur med sur vann. Resultat mus daglig bruk scoring GVHD scoring system utviklet av Cooke et al 1.
8. Bioluminescent Imaging
- Seks dager etter transplantasjon, injiserer mottaker mus med 4 mg D-luciferin. Tillat 5 min for å reagere med luciferin luciferase.
- Anesthetize mus i isofluran kammer av Bioluminescens imager og bilde mottakere i 5 min med små binning. Dette vil skape et høyoppløselig bilde samtidig samle så mange hendelser som mulig.
- Analysere data ved hjelp BoImage programvare. Omfanget av den pseudo-fargebilde kan endres for å gi de beste resultatene. Imidlertid er det viktig at den samme skala brukes på tvers eksperimenter.
- Regioner av interesse kan bli laget med levende bilde-programvare og lys emittance kan kvantifiseres ved å beregne fluks (fotoner / sek) som slippes ut fra hver region av interesse.
9. Representant Resultater
Omtrent 7-10 dager etter transplantasjon, mus begynner å vise kliniske tegn på GVHD. Mus vises scruffy grunn av mangel på stell. Mottakerne vil også begynne å gå ned i vekt mellom 7-10 dager etter transplantasjon. Aktivitet og holdning av mottaker mus vil holde seg relativt normalt inntil ca dag 12-14 etter transplantasjon. Kumulative GVHD Poengsummen vil stadig øke gjennom de første 2-3 ukene etter transplantasjon (figur 1A). Sykdomsforløpet er ganske variabel mellom mus, men bør mottakerne jevnt bukke under for GVHD med 30-40 days etter transplantasjon (figur 1B).
Figur 2 viser mottaker mus som ble fotografert 6 dager etter transplantasjon. Pseudo-farget skalaen viser varierende lys emittance hele kroppen med høyest lysintensiteten som slippes ut i milten og tarmen. CD8 T celle akkumulering i tarmen er i samsvar med tidligere funn 6. Mottaker mus kan settes tilbake i microisolator buret skal bli avbildet på et senere tidspunkt eller avlives for ex vivo avbildning.
| Kriterier | Grad 0 | Grad 1 | Grad 2 |
| Vekttap (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Holdning | Normal | Hunching bare i ro | Flere hunching; svekker movement |
| Aktivitet | Normal | Mild til moderat nedgang i aktiviteten | Stasjonær mindre stimulert |
| Pels tekstur | Normal | Mild til moderat ruffling | Alvorlig ruffling / dårlig grooming |
| Hudens tekstur | Normal | Skalering av poter / hale | Åpenbare områder av avdekt hud |
Tabell 1. Cooke et al utviklet dette scoring system i 1996 1. Mus skal scoret daglig på hvert av kriteriene til venstre. Hver mus gis en score på 0-2 for hver kriterier og den totale poengsummen er en sum av alle de individuelle score.
Figur 1. Livsfarlige bestrålt BALB.B ble transplantert med 10 7 beinmarg celler alene eller med 18x10 6 CD8 T-celle utarmet WT splenocyttene og 2x10 6 renset L2G85.B6 CD8 T-celler. A) Kliniske resultater data mottakere av beinmarg alene eller sammen med CD8 T-celle utarmet WT splenocyttene og renset L2G85.B6 CD8 T-celler. B) Overlevelsesdata av mottakere av beinmarg alene eller sammen med CD8 T-celle utarmet WT splenocyttene og renset L2G85.B6 CD8 T-celler. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Livsfarlige bestrålte BALB.B mus ble transplantert med 10 7 benmargceller alene eller sammen med 18x10 6 CD8 T-celle utarmet WT splenocyttene og 2x10 6 renset L2G85.B6 CD8 T-celler. Mottakere ble injisert med 4 mg D-luciferin via intraperitoneal injeksjon og ble fotografert med Xenogen IVIS i 5 min på små binning. Pseudo-fargede bilder er vist hvor lilla representerer lav intensitet og rødt representerer høy intensitet regioner av interesse ble trukket rundt hele mus og total forandring (fotoner / sek) ble kvantifisert.
Figur 3. Livsfarlige bestrålte BALB.B mus ble transplantert med 10 7 benmargceller alene eller sammen med 18x10 6 CD8 T-celle utarmet WT splenocyttene og 2x10 6 renset L2G85.B6 CD8 T-celler. Mottakere ble injisert med 4 mg D-luciferin via intraperitoneal injeksjon og ble fotografert med Xenogen IVIS i 5 min på små binning. Pseudo-fargede bilder er vist hvor lilla representerer lav intensitet og rødt representerer høy intensitet. Mottakere ble fotografert på A) 4 dagers, B) Dag 6, og C) Dag 8 innlegg overføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen for å indusere GVHD hos mus som presenteres her representerer en klinisk relevant modell av murine GVHD. Opprinnelig etablert av Berger et al. I 1994, er den C57BL / 6 i BALB.B belastning kombinasjon MHC-matchet, med GVHD dødelighet mediert av CD4 avhengige, CD8 T effektbokser 2, høyt ligner den vanligste kliniske scenario 3. Det er kjent at transplantasjonen CD8 T-celler alene ikke forårsaker GvHD i denne modellen, men er sykdomsprogresjon signifikant verre når både CD4 og CD8 T-celler er til stede i forhold til CD4 T celler alene. Videre har det vært et omfattende arbeid som viser immunodominant hierarki av immunresponsen til mindre histocompatibility forskjeller i denne modellen 10. Men det gjenstår en del uklarheter om roller for T celle undergrupper under ulike faser av GVHD 4. Upubliserte studier fra vårt laboratorium tyder på at CD4 T-celler spiller en dominerende rolle i tidlig GVHDhendelser, mens CD8 T-celler dominerer ved senere tidspunkt.
Muligheten til å spore T-celle akkumulering mønstre in vivo er et kraftig verktøy som har potensial til å teste hypoteser om CD4 og CD8 T-celle bidrag under GVHD. Mus transgene for firefly luciferase ble opprinnelig utviklet i laboratoriet av Dr. Robert Negrin 5. På grunn av deres konstituerende luciferase uttrykk, kan cellene fra disse donor mus spores in vivo ved hjelp av en ikke-invasiv avbildningsteknikk 5. En annen fordel med denne modellen er at den enkelte mus kan overvåkes over tid. Imidlertid, til tross gjentatt avbildning av mottaker mus, gjenstår eksperimentell variabilitet mellom mottakere. Som vist i figur 2, er utvalget av hele kroppen flussmiddel 2400000 og musen med den laveste fluks har mindre enn 60% av total kropp fluks enn musen med størst fluks. Fordi en enkelt luciferase transgene er tilstrekkelig for Tcell deteksjon, kan luciferase positive belastningen lett avlet for å skape doble transgene mus. Studier i vårt laboratorium har vist en rolle for integrinet CD103 fremme GVHD 6. CD103 er en integrinreseptor uttrykt på CD8 T-celler 7 og liganden er E-cadherin, som blir selektivt uttrykt på epitelceller 8,9. Opprette en CD103-/ - mus som er i stand til å uttrykke luciferase vil tillate eksperimenter for å teste ytterligere hypoteser om hvilken rolle CD103 i GVHD. Dette eksperimentelle teknikken er begrenset til vurdering av akkumulering mønstre mellom organer. Alternative teknikker må brukes til å belyse mobilnettet menneskehandel mønstre innenfor enkelte organer. Kobling av en klinisk relevant GVHD modell med bioluminescent bildebehandling vil hjelpe belyse kinetikken T-celle trafficking og relative bidrag av CD4 og CD8 T celler etter benmargstransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi står i gjeld til Alice Gaughan og Jiao-Jing Wang som fremragende teknisk støtte, intellektuell input, og moralsk støtte var instrumental i å flytte disse studiene fremover. Disse studiene ble støttet av NIH stipend AI036532 til GAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
