Summary
小鼠骨髓移植是一种被广泛使用的技术，研究在人类移植物抗宿主病的免疫机制。监测能力的T细胞贩运模式
Abstract
移植物抗宿主病（GVHD）的广泛使用的骨髓移植作为根治性治疗各种血液不足的限制阻挡。引起的成熟的同种异体反应性T细胞存在于注入收件人的骨髓移植物和移植物抗宿主病到主机器官造成损害。然而，在小鼠中，T细胞，必须添加到骨髓接种物以引起移植物抗宿主病。虽然大量的工作已经做了移植后的T细胞反应的特征，生物发光成像技术是一种非侵入性的方法来监测体内的 T细胞贩运模式。
致命的辐射，受体小鼠移植供体小鼠的骨髓细胞和脾细胞。从L2G85.B6（表达荧光素酶的转基因小鼠）T细胞亚群的移植。只移植特定的T细胞亚群，一个是能够跟踪特定的T细胞亚群在体内 ，并根据他们的位置，发展特异性T细胞亚群的作用，在促进移植物抗宿主病在不同时间点的假设。在预定的时间间隔移植后，受体小鼠的是使用精诺真IVIS CCD相机成像的。利用活体成像软件，可量化的光子强度（红色=高强度，紫=低强度）的基础上产生的伪彩色图像的光照强度。
受体小鼠移植后4-7天之间，开始出现临床症状，移植物抗宿主病。 Cooke 等人开发了一个评分系统进行定量疾病进展的基础上的受体小鼠皮毛质地，皮肤的完整性，活动，减肥，和姿势。小鼠每天的得分，和安乐死时，他们变得奄奄一息。受鼠一般垂死移植后的20-30天。
小鼠模型，移植物抗宿主病的免疫学研究的有价值的工具。选择性地移植特定的T细胞亚群人仔细辨认每个子集所扮演的角色的新低。非侵入性跟踪在体内的 T细胞反应的价值又增加了一层小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型。
Protocol
1。致命的辐射
- 放置最多10个受体小鼠成microisolator笼与要使用的照射装置兼容。
- 照射总剂量（总剂量为10 cGy的BALB.B收件人）在同等剂量总结。二照射3小时后第一个。注射液发生后，最终照射4-6小时之间。无论是铯-137源或RS2，000，辐照的照射小鼠。
- 酸化水之后的第二次辐射剂量，储存小鼠在microisolator笼，直到移植的时间。
2。脾细胞的制备
- 根据机构的指导方针，实施安乐死一个供体小鼠。每一个捐赠者通常会产生75x10 6 - 125x10 6脾细胞。使用CD8纯化试剂盒，将每只小鼠一般产生6×10 6 - 12×10 6 CD8 + T细胞。
- 先垂直2厘米切口2厘米的中线直接取出脾脏下的肋骨。通过毛，皮，内脏膜切割。
- 取出脾脏和创建将在40微升目筛培养皿中，用5％FBS的1640 RPMI脾单细胞悬液。使用注射器柱塞掰开脾脏，直到整个脾已经通过目筛网。
- 重复此过程，每个WT和L2G85.B6捐助的。收集所有的WT单细胞悬浮液1-50毫升锥形管，收集所有的L2G85.B6在一个单独的50毫升锥形管的单细胞悬液。
- 离心细胞在1,200 rpm离心10分钟，在4℃下粒料1640的RPMI重悬了5％FBS和计数细胞。
3。骨髓准备
- 去除皮肤的供体小鼠的后肢。
- 小心地剪去股骨和胫骨/腓骨尽可能多的肌肉组织。
- 删除后肢通过切割股骨远在髋关节。切掉后的爪子正下方胫骨/腓骨路口的。截骨应使用坚固的剪刀。
- 小心地取出所有剩余的肌肉组织。切断腓骨，相对较少的骨髓中发现腓骨和不值得的努力。
- 冷1640的RPMI 5％FBS和重复过程中与所述第二后肢后肢放置。每只小鼠20×10 6 - 40×10 6骨髓细胞之间产生。
4。骨髓清除
- 删除一个后肢从大的陪替氏培养皿中的媒体和地方，用少量的冷媒体（〜1毫升）。
- 剪去膝关节。使用注射器（体积> 5毫升），胫骨和抑制注射器插入皮下针，直到所有的红色物质是从内部胫骨。股骨重复此过程。丢弃剩下的骨头没有骨髓。第二后肢重复此过程。
- 创建到大培养皿中，并使用注射器的柱塞和40μL移液含有骨髓单细胞悬液目筛。移取单细胞悬液50毫升锥形管，并保持在冰上。
5。 CD3耗尽
有很多种方法，以消耗CD3 +细胞从骨髓。我们的实验室使用的一个工具包，由德国美天旎生物技术公司（CD3-生物素 - 130-093-021）。消耗CD3 +细胞从骨髓制造商的协议。今后将被称为Miltenyi公司试剂盒的缓冲液MACS缓冲液（2毫摩尔EDTA，0.5％BSA的PBS，pH值7.2）。
- 洗涤细胞，以1200rpm离心分离的脾细胞和骨髓细胞的10分钟，在4℃，并计数细胞。
- 删除ALL上清。的重悬骨髓细胞100μL，每10万骨髓细胞的MACS缓冲。
- 与CD3消耗继续使用制造商的协议。
- 洗净CD3贫乏的骨髓细胞在无菌PBS中的3倍。计数CD3耗尽骨髓细胞，并重新悬浮于适当的体积，注入10 7个细胞。
有很多种方法来净化从L2G85.B6小鼠的CD8 T细胞。此外，有几种方法来耗尽CD8 T细胞从WT脾细胞献血者。我们的实验室使用的试剂盒由德国美天旎生物技术公司（CD8消耗 - 130-049-401，CD8净化 - 130-095-236）。
- 在90μLMACS缓冲液每10 7细胞，重悬WT颗粒。根据制造商的协议（CD8消耗 - 130-049-401）继续CD8 T细胞耗竭。
- 在40μl的MACS缓冲器，每10 7个细胞重悬于L2G85.B6颗粒。继续CD8 T细胞纯化，根据制造商的协议（CD8净化 - 130-095-236）。
- 每个细胞计数人口，每个人口和洗3次，用无菌PBS。重悬在每个人口适当体积18×10 6 WT（CD8贫）脾细胞和2×10 6 L2G85.B6纯化的CD8 T细胞注入。
7。注射剂
- 合并10 7 CD3耗尽的骨髓细胞，18×10 6 WT（CD8贫）脾细胞，2×10 6 L2G85.B6纯化的CD8 T细胞的微量离心管中。洗净，用无菌PBS重悬在300微升。
- 到受体小鼠尾静脉注射细胞制备。应使用28号针头注射。
- 将老鼠与酸化水microisolator笼。日常使用的得分分数小鼠移植物抗宿主病（GVHD）评分系统由库克等人 1。
8。生物光学成像
- 六天移植后受体小鼠，注射4毫克D-荧光素。允许5分钟虫荧光素与荧光素酶反应。
- 5分钟，小分级，麻醉小鼠中的生物发光成像仪和图像收件人的异氟醚室。这将创建一个高分辨率的图像，同时收集尽可能多的事件可能。
- 分析数据使用活图片的软件。伪彩色图像的规模可以改变，以产生最好的结果。然而，这是必须的，整个实验中使用相同的刻度。
- 可以创建，使用活体成像软件和发射的光通过计算（光子/秒），被发射的每个关心区域的磁通，可以量化的感兴趣区域。
9。代表性的成果
约7〜10天移植后，老鼠开始显示，移植物抗宿主病的临床症状。小鼠出现，邋遢由于缺乏疏导。收件人也将开始减肥移植后7-10天之间。将保持相对正常，直到大约每天12-14移植后受体小鼠的活动和姿势的。累积移植物抗宿主病（GVHD）的分数将稳步增长，通过移植后第2-3周（ 图1A）。病程是相当变数之间的小鼠，但是，收件人应均匀屈从于移植物抗宿主30-40ð的AYS移植后（ 图1B）。
图2显示了成像的6天移植后受体小鼠。伪彩色刻度显示不同的发射光的整个身体所发出的光的强度在脾脏和肠道的最高。 CD8 T细胞堆积在肠道中与以往的研究结果6是一致的。受体小鼠中，可以放回microisolator笼在稍后的时间点进行成像或安乐死的体外成像。
| 标准 | 0级 | 1级 | 2级 |
| 减肥（wkly.） | <10％ | > 10％ - <25％ | > 25％的 |
| 姿势 | 正常 | ，拱起只有在休息 | 几个拱起，损害MoveMe的NT |
| 活动 | 正常 | 轻度至中度的活性降低 | 固定，除非刺激 |
| 毛皮质地 | 正常 | 轻度至中度的皱裂 | 严重的皱裂/差疏导 |
| 肌理 | 正常 | 缩放/尾的爪子 | 裸露的皮肤明显的地区 |
表1。Cooke 等人开发的，该评分系统于1996年1。小鼠每天应得分在左边的每个的标准。每个鼠标是为每个标准给予评分为0-2分的总成绩是所有个人得分的总和。
图1。致死剂量照射BALB.B移 植10 7骨单独或与18×10 6 CD8 T细胞的耗尽WT脾细胞和2×10 6个纯化L2G85.B6 CD8 T细胞的骨髓细胞。 A）临床评分数据受助人的骨髓，单独或与CD8 + T细胞耗尽WT脾细胞和纯化L2G85.B6 CD8 + T细胞。 B）生存资料的收件人单独或与骨髓枯竭WT脾细胞和纯化L2G85.B6 CD8 + T细胞CD8 + T细胞。 点击这里查看大图 。
图2。致死剂量照射BALB.B小鼠的移植与10 7个骨髓细胞单独或与18×10 6 CD8 T细胞的耗尽WT脾细胞和2×10 6个纯化L2G85.B6 CD8 T细胞。收件人分别注射4毫克D-荧光素，通过腹膜内注射，并进行5分钟，在小像素合并使用精诺真IVIS成像。诗紫色表示低强度和高强度区周围绘制整个鼠标和总的通量（光子/秒）进行定量红色代表eudo彩色图像显示。
图3。致死剂量照射BALB.B小鼠的移植与10 7个骨髓细胞单独或与18×10 6 CD8 T细胞的耗尽WT脾细胞和2×10 6个纯化L2G85.B6 CD8 T细胞。收件人分别注射4毫克D-荧光素，通过腹膜内注射，并进行5分钟，在小像素合并使用精诺真IVIS成像。紫色表示低强度，红色代表高强度，伪彩色图像显示。收件人成像A）第4天，B）第6天，C）后第8天转移。
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Discussion
这里介绍在小鼠体内诱导移植物抗宿主病的协议小鼠移植物抗宿主病的临床相关的模型。始建于1994年，Berger 等人。的C57BL / 6到BALB.B应变组合是MHC-匹配，移植物抗宿主病（GVHD）的死亡率介导的CD4依赖，CD8 + T效应2，高度相似，临床上最常见的情况3。它是已知的CD8 T细胞移植本身不导致在这个模型中移植物抗宿主病，但是，疾病的进展显着更糟时，CD4 +和CD8 + T细胞相比，CD4 + T细胞单独存在。此外，已经有大量的工作表示次要组织相容性的差异，在此模型10的免疫反应的免疫层次结构。但是，仍然存在一些含糊不清的T细胞亚群中的角色在不同阶段的GVHD 4。从我们的实验室未发表的研究表明，CD4 + T细胞的过程中发挥着主导作用早期移植物抗宿主病事件CD8 + T细胞占主导地位，而在稍后的时间点。
跟踪T-细胞在体内的积累模式的能力是一个功能强大的工具，有可能来验证假设CD4和CD8 T细胞在移植物抗宿主病的贡献。萤火虫荧光素酶的转基因小鼠，初步形成了实验室的罗伯特·Negrin 5。由于其构成的荧光素酶的表达，可以跟踪这些供体小鼠的细胞在体内使用一种非侵入性的成像技术5。这种模式的另一个优势是可以监控单个小鼠，随着时间的推移。然而，尽管重复成像的受体小鼠中，仍然存在着实验收件人之间的变化。正如在图2中所示的范围内的身体总通量是2400000和鼠标的最低通量具有不超过60％，比与最大磁通鼠标身体总通量。因为单一的荧光素酶基因是足够的Tc埃尔检测，荧光素酶的阳性菌株可以很容易地繁殖创造双转基因小鼠。在我们的实验室研究的整合CD103的作用，在促进GVHD 6。 CD103是表达于CD8 + T细胞的7和配体是E-钙粘蛋白，选择性地表达于上皮细胞8,9的整合。创建一个CD103-/ - 小鼠，能够表达荧光素酶将允许进行实验，以进行进一步的测试假设在移植物抗宿主病的作用CD103。这个实验技术的限制，以评估器官间的积累模式。必须使用替代技术，阐明细胞内个别器官贩运模式。耦合与生物发光成像的临床相关性移植物抗宿主病（GVHD）模型将有助于揭示了T细胞贩运和相对贡献CD4和CD8 T细胞骨髓移植后的动力学。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
爱丽丝高根和王娇静，其优秀的技术支持，智力投入，并提前将这些研究在道义上的支持，我们非常感激。这些研究是由美国国立卫生研究院资助AI036532支持GAH。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
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