Summary
Murin knoglemarvstransplantation er en meget anvendt teknik til at undersøge immunologiske mekanismer for transplantat-versus-host-sygdom hos mennesker. Muligheden for at overvåge T-celle trafficking mønstre
Abstract
Graft-versus-vært sygdom (GVHD) er den begrænsende barriere for en bred anvendelse af knoglemarvstransplantation som en kurativ terapi for en række hæmatologiske mangler. GVHD er forårsaget af modne alloreaktive T-celler til stede i knoglemarven graft, der infunderes i modtageren og beskadige vært organer. Men i mus, skal T-celler sættes til knoglemarven inoculum at forårsage GVHD. Selv om omfattende arbejde er blevet udført for at karakterisere T-celle responser efter transplantation, bioluminescerende billedteknologi er en ikke-invasiv fremgangsmåde til overvågning af T-celle trafficking mønstre in vivo.
Efter letal bestråling, er recipientmus transplanteret med knoglemarvsceller og splenocytter fra donormus. T-celledelmængder fra L2G85.B6 (transgene mus, der konstitutivt udtrykker luciferase) er inkluderet i transplantatet. Ved kun at transplantere visse T-celledelmængder er man i stand til at spore specifikke T-celledelmængder in vivo,og ud fra det sted, udvikler hypoteser om betydningen af specifikke T-celledelmængder at fremme GVHD på forskellige tidspunkter. Ved forudbestemte intervaller efter transplantation, der recipientmus filmede med en Xenogen IVIS CCD kamera. Lysintensiteten kan kvantificeres ved hjælp af Living Billede software til at generere et pseudo-farvebillede baseret på foton intensitet (rød = høj intensitet, violet = lav intensitet).
Mellem 4-7 dage efter transplantationen, begynder recipientmus at vise kliniske tegn på GVHD. Cooke et al. En udviklet et scoringssystem til kvantificering af sygdomsprogression baseret på recipientmus pels tekstur, hudens integritet, aktivitet, vægttab, og kropsholdning. Mus er scoret dagligt, og aflivet når de bliver døende. Recipientmus generelt blevet døende 20-30 dage efter transplantationen.
Murine modeller er værdifulde værktøjer for at studere immunologi GVHD. Selektivt transplantere især T-celle delmængder alnedture til omhyggelig identifikation af de roller hver delmængde spiller. Ikke-invasiv sporing T-cellereaktioner in vivo tilføjer endnu et lag af værdi for murine GVHD model.
Protocol
1. Letal bestråling
- Placere op til 10 recipientmus i en microisolator bur forenelig med strålerøret, der skal anvendes.
- Bestråle i 2 lige store doser opsummering total dosis (totaldosis = 9 cGy for BALB.B modtagere). Second bestråling skal være 3 timer efter første. Injektion bør være mellem 4-6 timer efter den endelige bestråling. Bestråle mus i enten Cs 137 kilde eller RS2, 000, strålerøret.
- Efter den anden strålingsdosis, gemme mus i microisolator bur med syrnet vand indtil tidspunktet for transplantation.
2. Splenocyt Forberedelse
- Aflive en donor mus efter fastlagte retningslinier. Hver donor generelt giver 75x10 6 - 125x10 6 splenocytter. Ved hjælp af CD8 rensning kits, hver mus generelt giver 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T-celler.
- Fjerne milten ved først at lave en lodret 2 cm indsnit 2 cm til højre for midterlinjen direkteunder brystkassen. Skær gennem pels, hud og visceral membran.
- Fjern milt og skabe en enkelt cellesuspension ved at milten i 40 ul mesh sigte i en petriskål med 1640 RPMI med 5% FBS. Anvende et sprøjtestempel at gå i opløsning milten indtil hele milten er blevet ført gennem mesh sigte.
- Gentag denne proces for hver WT og L2G85.B6 donor. Saml alle de WT enkelte cellesuspensioner i 1-50 ml konisk rør, og indsamle alle de L2G85.B6 enkelte cellesuspensioner i en separat 50 ml konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 1200 rpm i 10 min ved 4 ° C. Resuspender pellets i 1640 RPMI med 5% FBS og tælle celler.
3. Bone Marrow Forberedelse
- Fjern skind fra én bagben af en donor mus.
- Skær forsigtigt væk så meget muskelvæv som muligt fra lårben og skinneben / fibula.
- Fjern bagben ved at skære femur væk ved hofteleddet. Bortskåret bagpote lige under tibia / fibula skæringspunktet. Alle knoglen nedskæringer bør gøres ved hjælp af robuste saks.
- Forsigtigt fjerne eventuelle rester af muskelvæv. Skær fibula-relativt lidt knoglemarv findes i fibula og ikke umagen værd.
- Anbring bagben i koldt 1640 RPMI 5% FBS og gentag processen med den anden bagbenet. Hver mus bør give mellem 20x10 6 - 40x10 6 knoglemarvsceller.
4. Bone Marrow Removal
- Fjern en bagben fra medier og anbringes i store petriskål med en lille mængde af kolde medier (~ 1 ml).
- Skær væk knæleddet. Ved hjælp af en sprøjte (volumen> 5 ml), insert subkutan nål ind i skinneben og presse sprøjten, indtil rød materiale fjernes fra indre af skinnebenet. Gentag fremgangsmåden med lårbenet. Kassér resterende knogler blottet for knoglemarv. Gentag processen med anden bagbenet.
- Opret enkelt cellesuspension ved pipettering medier indeholdende knoglemarv i store petriskål og brug sprøjtestemplet og 40 pimesh sigte. Pipette enkelt cellesuspension til 50 ml konisk rør og holde på is.
5. CD3 Depletion
Der er en række måder at nedbryder CD3 +-celler fra knoglemarven. Vores laboratorium anvender et kit fremstillet af Miltenyi Biotec (CD3-biotin - 130-093-021). Nedbryder CD3 +-celler fra knoglemarven efter fabrikantens protokol. Pufferen for Miltenyi kits fremover vil blive kaldt MACS buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA i PBS, pH 7,2).
- Vask cellerne ved centrifugering splenocytter og knoglemarvsceller ved 1200 rpm i 10 min ved 4 ° C og tælle celler.
- Fjern alle supernatant. Resuspender knoglemarvsceller i 100 pi pr 10000000 knoglemarvsceller i MACS buffer.
- Fortsæt med CD3 udtynding ved hjælp fremstiller 'protokol.
- Vask CD3 udtømte knoglemarvsceller 3 gange i sterilt PBS. Count CD3 udtømt knoglemarvsceller og resuspenderes i en passende mængde til at injicere 10 7 celler.
Der er mange forskellige måder til at rense CD8 T-celler fra L2G85.B6 mus. Der er også flere måder at nedbryder CD8 T-celler fra WT splenocyt donorer. Vores laboratorium bruger kits fra Miltenyi Biotec (CD8 udtømning - 130-049-401, CD8 rensning - 130-095-236).
- Resuspendér WT pellet i 90 pi MACS Buffer per 10 7 celler. Fortsæt med CD8 T-celle depletion efter fremstiller »protokol (CD8 udtømning - 130-049-401).
- Resuspender L2G85.B6 pellet i 40 ul MACS buffer af 10 7-celler. Fortsæt med CD8 T-celle oprensning ifølge fremstiller »protokol (CD8 oprensning - 130-095-236).
- Tælle hver cellepopulation og vask hver population 3 gange med sterilt PBS. Resuspender hver population i et passende omfang at injicere 18x10 6 WT (CD8 forarmet) splenocytter og 2x10 6 L2G85.B6 oprensede CD8 T-celler.
7. Injektionspræparat
- Kombiner 10 7 CD3 udtømte knoglemarvsceller, 18x10 6 vægt (CD8 udtømt) splenocytter og 2x10 6 L2G85.B6 oprensede CD8 T-celler i et mikrocentrifugerør. Vask med sterilt PBS og resuspender i 300 gl.
- Injicere cellepræparat i halevenen af recipientmus. Injektioner bør ske ved hjælp af 28 gauge nåle.
- Store mus i microisolator bur med syrnet vand. Score mus dagligt med scoring GVHD pointsystem udviklet af Cooke et al 1.
8. Bioluminescent Imaging
- Seks dage efter transplantationen, injicere recipientmus med 4 mg D-luciferin. Tillad 5 min for luciferin at reagere med luciferase.
- Anesthetize musen i isofluran kammer af bioluminescens billeddanneren og billedfiler modtagere i 5 min med lille binning. Dette vil skabe et billede med høj opløsning, mens du samler så mange arrangementer som muligt.
- Analysere data ved hjælp LivingImage software. Omfanget af den pseudo-farve billede, kan ændres til at give de bedste resultater. Men det er bydende nødvendigt, at den samme skala anvendes på tværs af eksperimenter.
- Regioner af interesse kan oprettes ved hjælp Living Billede software og lys emittance kan kvantificeres ved at beregne flux (fotoner / sek), der udsendes fra hver region af interesse.
9. Repræsentative resultater
Ca. 7-10 dage efter transplantationen, mus begynde at vise kliniske tegn på GVHD. Mus synes scruffy på grund af manglende pleje. Modtagerne vil også begynde at tabe mellem 7-10 dage efter transplantationen. Aktivitet og kropsholdning af recipientmus vil forblive relativt normal indtil ca dag 12-14 efter transplantationen. Kumulative GVHD score vil stige støt gennem de første 2-3 uger efter transplantation (figur 1A). Sygdom kursus er helt variabel mellem mus, dog bør modtagerne ensartet bukke under for GVHD med 30-40 days efter transplantation (figur 1B).
Figur 2 viser recipientmus, der blev afbildet 6 dage efter transplantation. Pseudo-farvet skala viser varierende lys emittance hele kroppen med den højeste lysintensitet, der udsendes i milten og tarmen. CD8 T-celle-akkumulering i tarmen er i overensstemmelse med tidligere resultater 6. Recipientmus kan placeres tilbage i microisolator bur, der skal afbildes på et senere tidspunkt eller aflivet til ex vivo billeddannelse.
| Kriterier | Grad 0 | Grad 1 | Grade 2 |
| Vægttab (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Posture | Normal | Hunching kun i hvile | Flere hunching; forringer movement |
| Aktivitet | Normal | Mild til moderat fald i aktivitet | Stationær medmindre stimuleret |
| Fur tekstur | Normal | Mild til moderat ruffling | Svær ruffling / dårlig grooming |
| Hudens struktur | Normal | Skalering af poter / hale | Klare områder af blottet hud |
Tabel 1. Cooke et al udviklet dette scoringssystem i 1996 1. Mus skal scores dagligt på hvert af kriterierne til venstre. Hver mus fik en score på 0-2 for hvert kriterium, og den samlede score er summen af alle de individuelle scorer.
Figur 1. Letalt bestrålede BALB.B blev transplanteret med 10 7 knoglemarvceller alene eller sammen med 18x10 6 CD8 T celle reducerede WT splenocytter og 2x10 6 oprensede L2G85.B6 CD8 T-celler. A) Kliniske score data for modtagere af knoglemarv alene eller sammen med CD8 T-celle depleteret WT splenocytter og renset L2G85.B6 CD8 T-celler. B) Overlevelsesdata af modtagere af knoglemarv alene eller sammen med CD8 T-celle depleteret WT splenocytter og renset L2G85.B6 CD8 T-celler. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Letalt bestrålede BALB.B-mus blev transplanteret med 10 7 knoglemarvsceller alene eller sammen med 18x10 6 CD8 T celle reducerede WT splenocytter og 2x10 6 oprensede L2G85.B6 CD8 T-celler. Modtagere blev injiceret med 4 mg D-luciferin via intraperitoneal injektion og blev afbildet ved hjælp Xenogen IVIS i 5 minutter ved små binning. Pseudo-farvede billeder er vist, hvor lilla repræsenterer lav intensitet og rød repræsenterer høj intensitet Regioner af interesse blev trukket rundt om hele mus og samlede flux (fotoner / sek) blev kvantificeret.
Figur 3. Letalt bestrålede BALB.B-mus blev transplanteret med 10 7 knoglemarvsceller alene eller sammen med 18x10 6 CD8 T celle reducerede WT splenocytter og 2x10 6 oprensede L2G85.B6 CD8 T-celler. Modtagere blev injiceret med 4 mg D-luciferin via intraperitoneal injektion og blev afbildet ved hjælp Xenogen IVIS i 5 minutter ved små binning. Pseudo-farvede billeder er vist, hvor lilla repræsenterer lav intensitet og rød repræsenterer høj intensitet. Modtagere blev afbildet på A) dag 4, B) dag 6, og C) dag 8 efter overføringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen til induktion GVHD i mus præsenteret her repræsenterer en klinisk relevant model af murin GVHD. Oprindeligt oprettet af Berger et al. I 1994, er det C57BL / 6 i BALB.B stamme kombination MHC-matchet, med GVHD dødelighed medieret af CD4 afhængige, CD8 T effektorer 2, meget ligner den mest almindelige kliniske scenarie 3. Det er kendt, at transplantation af CD8 T-celler alene ikke forårsager GVHD i denne model, men sygdomsprogression er betydeligt værre, når både CD4-og CD8-T-celler er til stede i forhold til CD4-T-celler alene. Endvidere har der været omfattende arbejde viser den immundominante hierarki af immunreaktionen på mindre histocompatibility forskelle i denne model 10. Der er imidlertid stadig en vis uklarhed vedrørende roller for T-celledelmængder under forskellige faser af GVHD 4. Upublicerede undersøgelser fra vores laboratorium tyder på, at CD4 T-celler spiller en dominerende rolle i den tidlige GVHDarrangementer, medens CD8 T-celler dominerer på senere tidspunkter.
Mulighed for at spore T-celle ophobning mønstre in vivo er et stærkt værktøj, som har potentiale til at teste hypoteser om CD4 og CD8 T-celle-bidrag under GVHD. Mus transgene for ildflueluciferase blev oprindeligt udviklet i laboratoriet af Dr. Robert Negrin 5. På grund af deres konstitutive luciferaseekspression kan celler fra disse donormus spores in vivo ved hjælp af en ikke-invasiv billeddannelse teknik 5. En anden fordel ved denne model er, at individuelle mus kan overvåges over tid. Trods gentagne billeder af recipientmus, er der stadig eksperimentel variation mellem modtagerne. Som vist i figur 2, området af den totale flux er 2.400.000 og musen med den laveste flux er mindre end 60% af den totale flux end musen med den største flux. Fordi en enkelt luciferase transgen er tilstrækkelig til Tcell detektion, kan luciferase positive stamme let avlet til at skabe dobbelt transgene mus. Undersøgelser i vores laboratorium har vist en rolle for integrin CD103 fremme GVHD 6. CD103 er et integrin udtrykt på CD8 T-celler 7 og liganden er E-cadherin, som selektivt udtrykkes på epitelceller 8,9. Oprettelse af et CD103-/ - mus, der er i stand til at udtrykke luciferase vil muliggøre forsøg for at afprøve yderligere hypoteser om betydningen af CD103 i GVHD. Denne eksperimentelle teknik er begrænset til en vurdering ophobning mønstre mellem organer. Alternative teknikker skal udnyttes til at belyse cellulære menneskehandel mønstre inden for de enkelte organer. Kobling et klinisk relevant GVHD model med bioluminescerende billeddannelse vil hjælpe kaste lys på kinetikken af T-celle menneskehandel og relative bidrag af CD4 og CD8 T-celler efter knoglemarvstransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi står i gæld til Alice Gaughan og Jiao-Jing Wang hvis fremragende teknisk support, intellektuelle input, og moralsk støtte var medvirkende til at flytte disse undersøgelser frem. Disse undersøgelser blev støttet af NIH tilskud AI036532 til Gah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
