抛光和钢筋，颅骨变薄窗口，为长期的小鼠脑成像

Summary

我们提出了一个方法，形成一个横跨毫米，是没有大脑的炎症个月稳定在小鼠颅骨的影像窗口。这种方法非常适合于使用双光子显微镜的血液流通，细胞动力学，细胞/血管结构的纵向研究。

Abstract

在体内的皮质功能成像需要光纤接入无脑颅内环境的破坏。我们提出了一个方法，在小鼠颅骨，跨越直径几毫米个月的稳定形成抛光和钢筋颅骨变薄（端口）窗口。手举行演习，以实现光学清晰度头骨10至15微米的厚度变薄，然后覆盖氰基丙烯酸酯胶和玻璃盖：1）提供刚性，2）抑制骨的再生和3）减少光散射从骨表面上的违规行为。由于颅骨没有违反，任何可能会影响正在研究过程中的炎症，会大大减少。可以实现利用双光子激光扫描显微镜成像深度可达250微米以下的皮质表面。这个窗口非常适合研究脑血流和细胞的功能，在麻醉和清醒的准备。它进一步提供运portunity操纵细胞的活性，利用光遗传学或破坏由照射循环光敏剂的目标船只的血流量。

Protocol

1。准备手术， ^我

1. 清洁及手术Maxizyme超声波清洗机的牛奶混合物中超声分散的手术工具。高压灭菌之前，每个实验的外科手术工具。
2. 确保所有必要的试剂和耗材可用。表2中提供的试剂和耗材清单。试剂和耗材，在接触到暴露组织应该是无菌的，在可能的情况下。
3. 诱导麻醉。表1描述了适合生存研究的典型麻醉药。为缺乏脚趾掐反射的检查，以确保手术的麻醉平面。鼠标的最佳年龄是3至6周龄。年轻小鼠的头骨更柔软，更困难的要薄。年纪较大的老鼠有较厚的头骨，在细化过程中，会流血。
4. 固定在一个立体的第¹帧的动物。表2中提供手术设备清单。
5. 维持身体温度TURE在37°C使用一个反馈调节直肠探头和热垫。
6. 眼药膏的眼睛，以保持水分。
7. 一个小的电动剃须刀刮胡子的头皮。
8. 优碘，70％（V / V）异丙醇擦拭清洁头皮。
9. 如果需要，检查心脏和呼吸率正常使用脉搏血氧饱和度的范围内。鼠标，这些数字应该围绕10，分别为2赫兹。
10. 暖取无菌过滤的人工脑脊髓液（学联）37℃（125毫米氯化钠，葡萄糖10毫米，10毫米肝素钠， _氯化钙 3.1毫米，1.3毫米氯化镁_2，pH值7.4）（从Sigma的所有化学品） ^2。

2。安装一个头架

1. 一双镊子和手术剪，删除整个背头骨表面的头皮。修剪皮肤的头骨和后两侧颞肌边缘横向erior到颈部肌肉（ 图1A）。
2. 使用手术刀叶片去除颅骨表面薄薄的骨膜。
3. 清理用潮湿的棉花头骨放倒撒施，干燥的空气流从灰尘可以颅骨表面。然后应用到整个头骨表面的氰基丙烯酸酯胶的薄层。让胶水彻底干燥。这层胶需要适当的坚持在后续步骤中的牙科水泥。氰基丙烯酸酯胶，不需要进行消毒。
4. 附加一个金属连接器的颅骨表面，离所需的窗口面积。对于麻醉的准备，一个小螺母可固定的颅骨上，民建联的氰基丙烯酸酯胶，以后可以成像设置（ 图1B，1L和1N）使用螺栓拧。螺母背面用胶带密封，以确保胶不进入线程，在附件的头骨。螺母和磁带应消毒到手术前灭菌。
5. 对于清醒的成像准备，有两个附着点（ 图1M及1N）附加一个更加刚性的自定义连接器。对侧半球皮质与一个半毫米钻孔毛刺钻两个洞的头骨，然后引入两个＃000自攻螺钉。这些螺丝将有助于锚头安装到头骨。适用于只有一个螺丝的全面转向，以避免底层皮质施加压力。在小脑的小民建联的氰基丙烯酸酯胶，然后，将自定义的金属横栏。允许的氰基丙烯酸酯胶彻底晾干。这种金属连接器，大大降低了自由度，并简化了在相同的成像纵向研究领域的搬迁。宽的横栏提供了充足的空间电极安置和触须的刺激。生成自定义的头部安装及附件设备的详细计划，可在网上（SICS / links.html“> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html）。螺钉和横栏应消毒灭菌手术前。
6. 覆盖整个颅骨表面，不包括窗口的位置，用牙科水泥层，（ 图1C和1D）。确保所有暴露的皮肤边缘，被水泥覆盖。牙科水泥组件不需要进行消毒。

3。抛光的生成和增强减薄的头骨（端口）“窗口”

1. 确保钻孔毛刺是雪亮的，并避免重复使用它们。使用低速牙钻，一个半毫米毛刺地区体感皮层2毫米薄2毫米。湿冷却，疏干;润湿与学联的头骨，然后一个温柔的空气流气体除尘器干燥颅骨表面之间的替代。这就需要通过松的头骨，这可能会流血层变薄，但可以治理工程ED冲洗学联（ 图1E）。头骨开始弯曲轻微的压力下钻时〜50微米，应该通过湿骨（ 图1F）可见软脑膜血管。在此厚度，骨内的白色小点，将成为几秒钟后立即蘸干颅骨表面可见。
2. 在这一点上，瘦骨，甚至进一步。使用钻速度较慢，即每分钟1000转，刮胡子颅骨表面只有轻微的触摸。使用小的控制动作，而像一支钢笔钻，只适用于在横向方向的力量。骨应在其最终厚度（ 图1G）...... 10至15微米。当足够薄，骨是骨的小白斑将不再可见时蘸干颅骨表面。
3. 擦亮窗口区域与氧化锡粉。附加一个预制的钻头已在硅水族馆密封胶和蘸画，留下一个锥形鞭（ 插图，图1H）。硅鞭应在手术前准备至少一天，有70％的异丙醇，使用前消毒。学联（ 图1H）下降的窗口上放置一小捏粉。鼓动长达十几分钟的泥浆在窗户上轻轻抚摸头骨表面移动鞭尖。彻底冲掉锡氧化物粉末，从使用学联的窗口和干骨彻底温柔的空气流。在前面的步骤进行钻探留下的不规则表面和壁骨片应拆除抛光后（ 图1H和1I）。锡氧化物粉末，不需要进行消毒。
4. 切不见方的小块。 0盖玻片略高于窗口的大小要小得多。使用文士轻轻地使用直边盖滑得分分离的水平和垂直线。然后将其放置在培养皿和KN盖玻片玉珠对桌子边缘的菜分开的玻璃碎片。然后可以在整个培养皿灭菌，确保无菌。
5. 将适当大小的玻璃盖附近的干的窗口。应用使用一个破碎的木制棉棒撒施尖端的窗口小民建联氰基丙烯酸酯胶，并迅速推向胶水预切一块玻璃盖之上。避免产生气泡的玻璃盖下面。对头骨表面的玻璃盖轻轻一推，并保持几秒钟（ 图1J和1O）。允许胶彻底晾干后超过15分钟。可以去掉多余的氰基丙烯酸酯胶，干燥后用手术刀刀片从表面上的玻璃盖。用牙科水泥密封玻璃盖的边缘形成一个略有提高，以及举办水浸渍镜头（ 图1K和1O）。

4。复苏

1. 放置在一个温暖的笼子手术后的动物。监察动物定期，直到它完全从麻醉中恢复。
2. 如果超过一天的准备工作是为了生存，提供镇痛丁丙诺啡（0.03微克每克灭鼠）。我们通常形象的初始植入后动物至少一天。

5。成像的制备

1. 稳定的动物成像的光学线路板，用头支持（ 图1L及1M）的框架。限制装置，可从从Qioptiq或ThorLabs商业可用光学机械部件。我们的独立板可运送手术和双光子成像与动物和所有生理监测设备组装为一个单位^，3套房。
2. 如果所需的血流成像，注入0.05毫升的5％（W / V），荧光葡聚糖染料溶解在无菌生理盐水中，通过尾静脉或眶下静脉标记血清（ 图2A和2C至2H >）4-7。这必须在全身麻醉下完成。眶下静脉注射可能会更容易，对于初学者来说，葡聚糖解决方案是更粘稠。尾静脉难以找到深色小鼠，静脉趋于崩溃失败后的注射。成像血管与绿色发光，用异硫氰酸荧光素葡聚糖。为红光发射，使用德州红葡聚糖。超高分子量右旋糖酐，染料将继续留在流通了好几个小时。另外，与内源性荧光标记的动物，可以直接在适当的双光子激发波长成像。右旋糖酐液可以冻结等分，以供将来使用。
3. 潮湿的棉布轻轻擦拭窗口表面倾斜涂药。
4. 麻醉准备长期成像，体积3μL注入无菌乳酸林格氏液腹腔每克每2个小时，以维持体液和能源需求。/ LI>
5. 当成像在清醒状态的动物，只在几个小时的时间限制头枕，以减轻压力水平。返回动物的食物和水成像会话之间的家庭笼。

6。代表结果

一个成功的窗口将允许成像深度可达250微米以下脑膜表面几个月。使用该方法已在体内毛细血管血流量^4，8，小胶质细胞活化^8，9，和树突状结构的研究，在皮层薄壁^8。举一个例子，我们使用双光子成像显示麻醉Thy1系黄色荧光蛋白（YFP的）鼠标皮质血管后，血清标记是由得克萨斯红葡聚糖（ 图2A）静脉注射。硬脑膜血管往往略高于可见硬脑膜皮质表面（ 图2C，箭头 ）。大脑膜动脉和静脉李皮质表面E（图2D）。从这个表面网络和潜水到皮质，他们ramify成一个密集的毛细血管床，饲料皮层组织（ 图2E 2H）穿透血管分支。深表达YFP的皮层神经元，这鼠标线信号内源性的树突状乔木，同时在第二个通道^10（ 图2B，2H），可成像。骨的第二谐波信号被收集在第三个通道，可以用来衡量厚度减薄后的图像栈收集头骨（ 图2A 2C）。

皮质血管动力学正在深刻地影响麻醉药^11。在第二个例子中，我们展示了双光子显微镜收集从习清醒鼠标自发vasoactivity视频。突出管腔直径的血管收缩振荡与脑膜动脉，但不与邻近小静脉。这减少乌拉坦麻醉⁴基底范围vasoactivity的。量化自发和诱发血流的变化，我们使用改编线扫描技术，捕捉血管直径和红细胞速度，个别船只。定量血流成像，利用双光子显微镜的详细资源^，3，12。

图1。一个端口“窗口中的程序。 （A至K）连续过程中的步骤生成一个端口“窗口形象。看到详细的说明文字。 β=前囟门和λ=拉姆达。 （L）的系统，确保在麻醉准备成像头螺栓和螺母。 （男）自加工清醒准备横栏头安装。在这个例子中，连接器也被植入重复脑电录音。 （N）的示意图头部安装各部件的位置和背视图。作为替代使用在面板研究两个横栏面板大号螺母是＃000自攻螺钉与横栏安装与稳定清醒成像准备增加补充。 （O）的示意图显示的端口“窗口中的横截面。

图2。双光子成像的血管和神经元在小鼠皮层的结构 。所有图像采集在Thy1系YFP的鼠标在窗口植入后¹⁰天内，通过一个端口“窗口。组织超过150微米的最大投影在冠状血管（A）和树突（二）稀释头骨方向。通过收集450 nm发射900 nm激发二次谐波荧光检测骨（蓝色） 6。神经元的树突领域（绿色）是内源性的Thy1系YFP的转基因小鼠线。超过50微米的组织，在水平方向不同深度低于PIA（CH）的最大预测。数据是从面板中显示相同的图像栈A和B.硬脑膜血管可能略高于皮质表面可见（ 在C箭头 ）。

缩略语

学联=人工脑脊髓液
PORTS =抛光和钢筋变薄颅骨窗口
YFP的=黄色荧光蛋白

^确保所述的程序批准由当地机构动物护理和使用委员会。

Discussion

通过一个端口“窗口中的双光子成像需要通过传输薄骨和硬脑膜，衰减激光和光学像差增加了更大的深度^8。然而，尽管这个缺点，成像深度可达250微米以下脑膜表面可以达到900 nm激发。大成像深度可能在原则上有可能与较长的激发波长^13。这种方法的主要优点是皮质炎症的情况下，可能存在短暂的涉及全开颅^14，15的方法。一个精心准备的端口窗口应显示血管生成或炎症没有明显的迹象后，植入^8。这可能是在实验成像血管结构的过程中，或通过检测的CX（3）红细胞CR1-GFP小鼠^8号线^，16，17小胶质细胞的形态变化评估在体内 。此外， 事后免疫组化，应该是每形成确认在浅表皮层的星形胶质细胞增生的情况下，例如，使用胶质纤维酸性蛋白的抗体。

在最苛刻的步骤生成一个端口“窗口10至15微米的厚度变薄，骨。定期检查窗口宽场荧光解剖显微镜下也很有用，来衡量颅骨的厚度，在细化过程中。通过湿头骨附近的皮质表面的荧光标记应清晰可见。骨第二谐波信号的头骨厚度更准确的测量，可以测量一个三维堆叠下双光子显微镜（ 图2A 2C）。如果这样做之前应用的胶水和玻璃盖，骨，如有必要可以进一步细化。结果在贫困成像深度不够细化。抛光会继续瘦的头骨时，钻井不再是可能的，这将有助于减少表面的不规则性和附着的骨片。在初步研究中，我们发现，抛光提高成像深度星期后，最初的植入。然而，尚未进行严格抛光的利益分析。

氰基丙烯酸酯胶和玻璃盖骨上面的应用是一个关键步骤，以减少光散射，并允许进行更深入的成像。由于钻井过程中，骨的表面是不规则的，即使经过抛光，因此散射光。氰基丙烯酸酯胶中的应用，填补了这些违规行为，并覆盖玻璃叶非散射，表面光滑。重要的是，胶水和玻璃盖，这是1.45和1.52根据制造商的规格，折射率密切变址匹配骨1.55 ^18。这是比以上的变薄的头骨有空气或水的改善，其中有1.00折射率ð1.33。关键的是，氰基丙烯酸酯胶有助于进一步阻碍骨骼重新生长。这使得长达三个月的纵向成像，而不为初次手术后需要额外的维护。

第二个原因是一个贫穷的成像深度破坏软脑膜血管，导致出血或水肿。应尽量减少从钻头的振动。在小比例的情况下，在硬脑膜出血将是不可避免的。这是因为血管硬脑膜与颅骨的血管丛，这是在细化过程中的干扰是连续的。硬脑膜增厚和血管生成将接踵而至，准备与任何分硬脑膜出血的迹象，应丢弃。的端口“窗口中的成功率可高达80％与实践高。

对于一些实验，它可能需要注入染料/病毒或插入电极下方的端口“窗口组织。它有可能产生小相邻的窗口，移液器或电极，通过它可以推出采用立体定向手臂或萨特机械臂¹⁹洞。这个洞可以再封好，用骨蜡，如果动物是在今后各届会议再次进行成像。然而，引进电极可以如蔓延抑郁的皮质和急性病理炎症过程中的铅。

端口“窗口中，应适合于任何方式要求光纤接入到大脑成像。这包括内在的光学成像和激光散斑成像^21，或如²²共聚焦或双光子显微镜²³光学切片技术，如表面成像技术。此外，端口准备工作应在广泛的领域，如光学相干断层扫描²⁴和 ​​光声显微镜²⁵颅成像技术提高分辨率。

最后，端口窗口适用于玻璃盖清醒动物成像增加了刚性的窗口^4。头架引进两个自攻螺丝，＃000对侧半球的牙科水泥（ 图1L）申请前进一步稳定。重要的是减少动物的运动习惯，以头固定在成像。可以逐渐习惯于一种新的动物头克制了为期3至7天前成像，用15分钟的会议，并开始工作了几个小时。