抛光和钢筋，颅骨变薄窗口，为长期的小鼠脑成像

该程序的总体目标是在小鼠皮层上产生一个稳定、薄的颅骨窗口，以允许重复成像，而不会破坏颅内环境。这是通过首先连接一个头戴式支架来实现的，该支架可以让头部稳定地固定在成像装置下方。接下来，小心地在大脑背表面的某个区域减薄颅骨，并用细砂打磨表面。

然后用一小滴氰基丙烯酸酯胶和盖玻片盖住窗户，以加固窗户。最后一步是准备动物在双光子显微镜下成像。最终在体内，双光子显微镜用于显示精细结构，例如动脉、静脉毛细血管和神经元树突，这些结构可以在数周内对皮层深达 250 微米的成像。

这种颅窗技术的主要优点是覆盖在皮层上的头骨是无法到达的。首先，我们将头骨变薄以获得光学清晰度，然后我们用氰基丙烯酸酯胶和盖玻片加固头骨。该方法应该可用于研究麻醉或 OIC 状态下的荧光转基因小鼠的多样性。

要开始此过程，请使用所需的手术工具进行高压灭菌，根据随附手稿中的方法在大约 3 到 6 周大时麻醉小鼠。通过捏脚趾检查反射，以确保鼠标处于麻醉的手术平面内。接下来，将鼠标固定在立体定位框架中。

将鼠标的体温保持在 37 摄氏度。使用反馈调节的直肠探头和加热垫。将眼药膏涂抹在眼睛上以保持水分。

然后用小电动剃须刀剃掉头皮。之后，用 Betadine 清洁头皮，然后用 70% 异丙醇擦拭。然后在显微镜下将等分试样的无菌人工脑脊髓液加热至 37 摄氏度。

用一把手术剪刀去除整个颅骨背侧表面的头皮。横向修剪皮肤至颅骨两侧和颈部肌肉后方的颞肌边缘。接下来，使用手术刀刀片从颅骨表面去除薄的骨膜。

然后擦干并清洁头骨。之后，在颅骨表面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶。让胶水彻底干燥。

这层胶水是正确粘附牙科粘固剂所必需的。在后续步骤中。对于清醒成像准备，钻孔并将两个 0 0 0 0 数字自攻螺钉引入对侧颅骨表面。

然后将带有两个连接点的刚性定制连接器连接到头骨上。这大大降低了自由度，并简化了纵向研究中同一成像区域的重新定位。宽横杆还为电极放置和激发活力提供了充足的空间。

接下来，用一层牙科水泥覆盖整个颅骨表面，不包括窗户的位置，确保皮肤的所有裸露边缘都被水泥覆盖。在稀释头骨之前，确保钻头锋利并避免重复使用它们。使用牙钻低速在体感皮层上用半毫米的毛刺薄出 2 毫米 x 2 毫米的区域。

然后，用 CSF 定期用 CSF 使颅骨表面一次薄化几秒钟，以防止发热。然后减薄骨头。进一步将钻头切换到较慢的速度，只需轻轻触摸即可剃除颅骨表面。

钻头应与垂直方向成大约 30 度角接近表面。继续使骨骼变薄，越过血管层进入第二层骨骼。大脑表面以上。

以小的受控动作握住钻头，并且仅在横向施加力。当骨骼厚度约为 50 微米时，应通过湿骨清晰地看到果皮血管。在这个深度中，骨骼内的小白点将在几秒钟内变得可见。

湿润干燥的颅骨表面后，最终的骨骼厚度应立即约为 10 至 15 微米。当骨骼足够薄时，当干燥的颅骨表面湿润时，骨骼中的小白点将不再可见。现在用氧化锡粉擦亮窗户。

使用一小撮粉末，大约是窗口大小的四分之一，使用带有硅胶鞭的预制钻头，用 CSF 搅拌粉末浆。将表面抛光 10 分钟，彻底冲走窗户上的氧化锡粉，然后擦干骨头。这个过程应该有助于减少钻头在减薄过程中留下的任何粗糙边缘。

接下来，切下几块方形的零号盖玻片，尺寸略小于窗户的尺寸。使用划线器轻轻地在封面中划线分隔的水平线和垂直线。用直边滑动而不会打破玻璃。

然后将盖玻片放入培养皿中。将盘子敲击桌沿，将玻璃块分开。然后，使用破损的棉签涂抹器的木头在窗户上涂抹一小滴 Sano ACRL 胶水。

在胶水上快速放置一块预先切割好的盖玻片。避免在胶水彻底干燥 15 分钟后在盖玻片下方产生气泡。用手术刀刀片从盖玻片的上表面去除多余的氰基丙烯酸酯胶。

用牙科水泥密封窗户的边缘。然后形成一个略微凸起的井，为浸渍镜头保持水分。将动物放在温暖的笼子里，直到它从麻醉中完全恢复。

在此步骤中，将动物稳定在光学面包板上进行成像，并使用框架作为头部支撑。我们的独立板可以在手术和两个光子成像部位之间运输动物和组装成一个单元的所有生理监测设备。如果需要血流成像，通过眶下静脉注射 0.05 毫升 5% 荧光葡聚糖染料，以标记血清。

这必须在全身麻醉下进行，并且染料通常会在循环中保持数小时。每两小时以每克 3 微升的体积腹膜内注射乳酸林格溶液，以维持体液和能量需求。通过停止使用异氟醚来唤醒鼠标。

唤醒 1 小时后，鼠标已准备好进行成像。关闭显微镜上的笼子以防止光污染。显示。这是大腿皮质脉管系统的一个例子，一只通过静脉注射葡聚糖共轭的德克萨斯红硬脑膜血管标记的 YFP 小鼠通常在硬脑膜皮质表面略上方可见。

大的剥脱动脉和 es 位于皮质表面。穿透血管从这个表面网络分支出来，潜入皮层，在那里它们分叉成一个致密的毛细血管床，为皮质组织提供营养。这部电影显示了清醒小鼠果皮表面的脉管系统。

当动物处于安静的休息状态时，可以看到动脉直径的自发振荡。这种方法应该可用于研究处于麻醉或清醒状态的各种荧光跨音速动物。