Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.
Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne 1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E 'diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule 3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l'architettura biologica 3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi.
L'importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta 4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali 5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali 6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini 7.
Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l'apoptosi, l'angiogenesi e l'invasione 8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) 16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all'interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l'invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali 23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l'analisi degli effetti dell'esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.
Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all'interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati…
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | ThermoScientific | SH30023.01 | |
Hyclone Bovine Calf Serum | ThermoScientific | SH3007303 | |
Insulin | EMD Chemicals | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |