Síntese de um<em> Em vivo</em> Sonda Apoptosis MRI-detectável
Summary
A detecção precoce de apoptose pode identificar populações de risco de células em uma variedade de doenças. Aqui demonstramos um método para ligar uma proteína de apoptose de detecção precoce (anexina V) a uma nanopartícula de óxido de MRI-detectável de ferro (SPIO). Este método pode ser estendido para outras proteínas de interesse para gerar sondas de ressonância magnética-detectáveis de imagens moleculares.
Abstract
Apoptose celular é uma característica proeminente de muitas doenças, e esta morte celular programada normalmente ocorre antes de manifestações clínicas da doença são evidentes. Um meio para detectar apoptose em suas primeiras etapas reversíveis e iria pagar um pré-clínica "janela" durante o qual as medidas preventivas ou terapêuticas podem ser tomadas para proteger o coração contra danos permanentes. Apresentamos aqui um método simples e robusto para conjugar humano anexina V (ANX), que avidamente se liga às células durante as primeiras, etapas reversíveis de apoptose, a superparamagnéticas óxido de ferro (SPIO) nanopartículas, que servem como um agente de contraste para IRM-detectável. O método de conjugação começa com uma oxidação das nanopartículas SPIO que oxida grupos carboxilo na casca de polissacárido de SPIO. Proteína purificada ANX é então adicionado na configuração de uma solução de borato de sódio para facilitar a interacção covalente de ANX com SPIO num tampão de redução. Um passo de redução final com borohydrid de sódioe é realizada para completar a redução, e, em seguida, a reacção é arrefecida. ANX não conjugada é removido da mistura por filtração microcentrifugadora. O tamanho e pureza do produto ANX-SPIO é verificada por dispersão dinâmica de luz (DLS). Este método não necessita de adição a, ou a modificação de, o polissacárido SPIO concha, em oposição a ligação cruzada de partículas de óxido de ferro métodos de conjugação ou biotina-rotulados nanopartículas. Como resultado, este método representa uma abordagem simples, robusto que pode ser alargado a conjugação de outras proteínas de interesse.
Protocol
Discussion
O método de conjugação descrito para a ligação de SPIO a anexina V explora os grupos de cadeia lateral de amina de anexina e as porções carboxilo da nanopartícula SPIO. Através específicos de oxidação-redução passos, ligação covalente destes compostos pode ser alcançado, e as nanopartículas resultante funcionalizado pode ser isolado. Este método pode ser generalizado a outras proteínas e nanopartículas de interesse.
Os passos mais críticos são as condições de oxidaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5′-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
