Summary

Síntese de um<em> Em vivo</em> Sonda Apoptosis MRI-detectável

Published: July 31, 2012
doi:

Summary

A detecção precoce de apoptose pode identificar populações de risco de células em uma variedade de doenças. Aqui demonstramos um método para ligar uma proteína de apoptose de detecção precoce (anexina V) a uma nanopartícula de óxido de MRI-detectável de ferro (SPIO). Este método pode ser estendido para outras proteínas de interesse para gerar sondas de ressonância magnética-detectáveis ​​de imagens moleculares.

Abstract

Apoptose celular é uma característica proeminente de muitas doenças, e esta morte celular programada normalmente ocorre antes de manifestações clínicas da doença são evidentes. Um meio para detectar apoptose em suas primeiras etapas reversíveis e iria pagar um pré-clínica "janela" durante o qual as medidas preventivas ou terapêuticas podem ser tomadas para proteger o coração contra danos permanentes. Apresentamos aqui um método simples e robusto para conjugar humano anexina V (ANX), que avidamente se liga às células durante as primeiras, etapas reversíveis de apoptose, a superparamagnéticas óxido de ferro (SPIO) nanopartículas, que servem como um agente de contraste para IRM-detectável. O método de conjugação começa com uma oxidação das nanopartículas SPIO que oxida grupos carboxilo na casca de polissacárido de SPIO. Proteína purificada ANX é então adicionado na configuração de uma solução de borato de sódio para facilitar a interacção covalente de ANX com SPIO num tampão de redução. Um passo de redução final com borohydrid de sódioe é realizada para completar a redução, e, em seguida, a reacção é arrefecida. ANX não conjugada é removido da mistura por filtração microcentrifugadora. O tamanho e pureza do produto ANX-SPIO é verificada por dispersão dinâmica de luz (DLS). Este método não necessita de adição a, ou a modificação de, o polissacárido SPIO concha, em oposição a ligação cruzada de partículas de óxido de ferro métodos de conjugação ou biotina-rotulados nanopartículas. Como resultado, este método representa uma abordagem simples, robusto que pode ser alargado a conjugação de outras proteínas de interesse.

Protocol

Adaptado a partir de estudo prévio 1. 1. Conjugação de anexina V para SPIO Oxidar partículas SPIO (oceano Nanotech Inc., 5 mg / mL) durante 1 hora a 20 ° C no escuro em solução com 0,15 M de sódio periodato (NaIO4) (4:1 em peso: proporção em peso) 2. Incubar a SPIO oxidado durante 12 horas com purificado ANX proteína (proporção 1:1, peso: peso) em borato de sódio 0,15 M (Na 2 B 4 O 7 10H <sub…

Discussion

O método de conjugação descrito para a ligação de SPIO a anexina V explora os grupos de cadeia lateral de amina de anexina e as porções carboxilo da nanopartícula SPIO. Através específicos de oxidação-redução passos, ligação covalente destes compostos pode ser alcançado, e as nanopartículas resultante funcionalizado pode ser isolado. Este método pode ser generalizado a outras proteínas e nanopartículas de interesse.

Os passos mais críticos são as condições de oxidaç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).

American Heart Association (JL).

Stanford University, VPUE Grant (JL).

Materials

Name of Reagent Company Catalogue #
Superparamagnetic iron oxide Ocean Nanotech, Inc. ICK-40-005
Doxorubicin Sigma D1515-10MG
SuperMag Separator Ocean Nanotech, Inc. N/A
Zetasizer Nano DLS machine Malvern, Inc N/A

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Cite This Article
Lam, J., Simpson, P. C., Yang, P. C., Dash, R. Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe. J. Vis. Exp. (65), e3775, doi:10.3791/3775 (2012).

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