Summary
Vi viser FRET mellem konjugeret polymer polydiacetylene (PDA) og fluorofor bundet til overfladen af PDA liposomer til affølingen af biomolekyler. PDA liposomer indeholdt også receptormolekyler på deres overflader for biomolekyler, der skal anvendes som prober. Ligand-receptor-interaktioner fører til ændringer i FRET effektivitet mellem fluoroforen og PDA som er grundlaget for følemekanisme.
Abstract
FRET er en proces, hvor energi er ikke-radiativt overført fra en exciteret donormolekyle til en ground state acceptor molekyle gennem langtrækkende dipol-dipol interaktioner 1. I det foreliggende sensing assay, benytter vi en interessant egenskab ved PDA: blå-forskydning i det UV-synlige elektroniske absorptionsspektrum for PDA (figur 1) efter en analyt vekselvirker med receptorer knyttet til PDA 2,3,4,7. Denne ændring i PDA absorptionsspektrum giver ændringer i spektral overlapning (J) mellem PDA (acceptor) og rhodamin (donor), der fører til ændringer i FRET effektivitet. Således er vekselvirkningen mellem analyt (ligand) og receptorer detekteres via FRET mellem donor fluoroforer og PDA. Især viser vi affølingen af en model proteinmolekyle streptavidin. Vi viser også den kovalente-binding af bovint serumalbumin (BSA) til liposomoverfladen med FRET mekanisme. Disse interaktioner mellem than dobbeltlag liposomer og proteinmolekyler kan sanses i real-tid. Den foreslåede fremgangsmåde er en generel metode til at føle små kemiske og store biokemiske molekyler. Da fluorescens er i sig selv mere følsom end kolorimetri, kan detektionsgrænsen for assayet være i sub-nanomolære område eller lavere 8. Endvidere kan PDA fungere som en universal acceptor i FRET, hvilket betyder, at flere sensorer kan udvikles med PDA (acceptor) funktionaliseret med donorer og forskellige receptorer bundet på overfladen af PDA liposomer.
Protocol
A. Syntese og karakterisering af PDA liposomer 4,5,6
Note 1: Beskyt PDA-løsning fra lys ved hjælp af aluminiumsfolie indpakning på hver beholder i alle de eksperimentelle trin.
Note 2: To forskellige sæt liposomopløsning (B og C) blev fremstillet følgende procedure A (Syntese og karakterisering af PDA liposomer).
1. Syntese af N-hydroxysuccinimid Diacteylene (NHS-PCDA)
- Til fremstilling af liposomer, er en vigtig ingrediens PCDA-NHS påkrævet. Vi har syntetiseret PCDA-NHS anvendelse af følgende procedure:
- Tilsættes 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hydroxysuccinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) og 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (0,144 g, 0,713 mmol ) i tørt CH2 Cl2 (20 ml).
- Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer.
- Forsigtigt fjerne opløsningsmidlet ved hjælp af rotary fordamper til opnåelse af en tør tynd film.
- Brug skilletragt at ekstrahere remanensen med diethylether (25 ml) og vand (25 ml) tre gange.
- Det organiske lag tørres med MgSO4 (1,0 g) i en halv time. Der filtreres, og opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning til opnåelse af et hvidt fast pulver (0,24 g,> 90%).
- Analysere slutforbindelse under kernemagnetisk resonans (NMR).
- 1H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Liposompræparat 5,6,7
- Opløs PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) :: 8: 1: 1 i 20 ml dichlormethan.
- Opløsningen filtreres med filterpapir for at fjerne aggregater.
- Opløsningsmidlet afdampes fuldstændigt til opnåelse af en tynd film af monomerer.
- Tør den tynde film natten over under vacuum.
- Hydratisere filmen med deioniseret vand (50 ml) for at gøre et liposom opløsning af den ønskede koncentration (fra 0,65 til 1 mM).
- Sonikeres den resulterende suspension med en sonde-sonikator ved 76 ° C i ~ 18 min.
- Omhyggeligt sendes gennem et papirfilter til fjernelse af lipidaggregater
- Opløsningen afkøles ved 4 ° C natten over for at fremme selvsamling af monomererne. Den endelige opløsning skal være optisk klar.
- Polymerisere de selv-samlet diacetylene monomerer (liposom) ved bestråling med 254 nm UV-stråling for ~ 2 min ved anvendelse af en pen Ray UV-kilde (4,5 mW / cm 2) i luft.
- Liposomet opløsning var stabil ved stuetemperatur i mindst to uger. Løsningen blev mere stabilt, når nedkølet.
B. Fremstilling af rhodamin-mærkede Bovint serumalbumin (BSA-Rh) modificerede PCDA liposomer
1. Binding af BSA-Rh til liposomoverfladen
- Opløs BSA-Rh i PBS buffer (ionkoncentration var 0,01 M, pH 7,2) at foretage den endelige koncentration på 1,2 uM af BSA-rhodamin opløsning.
- Tilsættes 2 ml (1,2 uM) i BSA-rhodamin til 10 ml liposom opløsning fremstillet i trin A.2. (Se ovenfor) ved stuetemperatur.
- Klassisk reaktion for bindingen af amingrupper fra lysinresten af proteiner til carboxylsyre aktiveres af NHS-gruppen er blevet fulgt (Reaktionsskema i figur 2). NHS-PCDA blev udformet (figur 2, trin 1) til covalent binding proteinmolekyler med liposomer ved anvendelse af NHS-amin-reaktioner (figur 2, trin 2). NHS er en fremragende forlader middel, der driver amin-carboxylsyre reaktion i fremadretningen. Udbyttet af denne reaktion under passende betingelse skal være kvantitativ.
- Fjernelse af BSA-Rh: Soak en Spectra / Por Biotech celluloseester (CE) membran (MW C O: 100.000) i deioniseret water i 15 min. Denne membran anvendes til dialyse af uomsat BSA-rhodamin (Molekylvægt ~ 66.000 Da) i deioniseret vand.
- Omhyggeligt overføres opløsningen i den dialysemembran.
- Skift vand ved 2 timer, 8 timer, 14 timer, 24 timer og 36 timer under dialyse.
- Opsaml den endelige opløsning i et hætteglas dækket med aluminiumfolie.
C. Fremstilling af SR-diamin og Biotin-mærkede liposomer
1. Stedet for at bruge DMPC i trin 2.1 vil vi anvende biotin-mærkede (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl) (biotin-DOPE).
- Følg alle trinene igennem fra 2,2 til 2,9.
- I stedet for BSA-Rh i trin B, anvende diamin kodet Sulphorhodamine (SR-diamin).
- Følg alle yderligere skridt i B.
- Liposomerne i dette præparat indeholdt biotin og SR-diamin på deres overflader. Efterfølgende trin svarede til A og B (se ovenfor) med en enkelt undtagelse: streptavidin blev tilsat til solutipå at undersøge biotin-streptavidin-vekselvirkninger gennem ændringer i FRET effektivitet.
D. repræsentative resultater
Title fig. En tegning forklarer reaktionen og FRET proces optræder ved liposomoverfladen (fremstillet ved at følge trin B).
A. Kontrol med protein binding til liposomer under anvendelse af FRET 1
Overvågning af FRET mellem rhodamin og PDA liposomer fremstillet i trin B.
Excitations-og emissionsspektraene for BSA-Rh og absorptionsspektret for PDA træffes (figur 3A). Vi kan tydeligt se, at emissionsspektret af BSA-Rh overlapper med absorptionsspektret for PDA. Dette opfylder resonans kravet om FRET mekanismen. BSA-Rhodamine mærkede liposomer før og efter polymerisation blev analyseret med UV-Ver og fluorescensspektroskopi. For det isolerede donor og acceptor, FRET effektivitet er meget afhængig af donor-acceptor-afstand (r) og J1 (j-værdi). Quenchingen i emissionen observeres (figur 3B) på grund af FRET mellem rhodamin og PDA grund af fremkomsten af elektroniske absorptionsspektrum af blå PDA efter fotopolymerisation. I vores tilfælde effektivitet er nul for upolymeriserede liposomer og rhodamin FRET, fordi J = 0 for upolymeriserede liposomer i det synlige område.
Vi udførte tilsvarende eksperimenter med kun PDA liposomer, som ikke indeholdt NHS på deres overflade. I disse tilfælde blev BSA-Rh ikke mærket til overfladen af liposomerne. I dette tilfælde var den gennemsnitlige afstand mellem rhodamin og PDA (r gennemsnit) meget større end Forster radius (R 0 = 2,8 nm). Således har vi ikke observere et stort fald i fluorescensintensiteten. Denne observation aLSO antyder, at fluorescensundertrykkelse er dominerende når R <2,8 nm.
J og R 0-værdier blev beregnet ved hjælp af følgende formler: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6
Er ekstinktionskoefficienten (ε) af blå-PDA er i området ~ 2000-10000 M-1 cm-1 før tilsætning af streptavidin. Ekstinktionskoefficienten for blå-PDA er afhængig af foto-polymerisation tilstand. [2] For eksempel vil e værdier være større for en løsning, der blev polymeriseret længere tid. Ydermere kan selvsamling af de diacetylene monomerer også påvirke e værdier. The J calcultioner tage hensyn til disse ændringer, og de afspejler ændringer i de PDA ekstinktionskoefficienter grund biotin-streptavidin molekylære interaktioner. J-værdier beregnes ved hjælp eksperimentel PDA absorption og SR-101 emissionsdata. Ændringerne i J-værdier skyldes skifte i den elektroniske absorptionsspektrum af PDA efter tilsætningen af streptavidin til opløsningen (figur 4C). Enheden for J-værdier er M -1 cm -1 nm 4.
B. Kontrol af FRET ved tilsætning af streptavidin til biotin-mærket liposomopløsningen
Note 1: Overvågning af FRET mellem rhodamin og PDA liposomer fremstillet i trin C ovenfor.
Excitations-og emissionsspektre af mærket Sulphorhodamine-diamin (SR-diamin) og absorptionsspektret for PDA træffes (figur 4A). Upolymeriserede og polymeriserede biotin mærkede liposomer blev analyseret under anvendelse af UV-Visog fluorescensspektroskopi. Emissionen af rhodamin (SR-101) er reduceret med omkring 45% efter polymerisation (figur 4B) tyder emission quenching grund af FRET. Tilsættes 40 pi alikvoter (1 uM) af streptavidin opløsning til 2 ml liposomopløsningen. Med tilsætning af streptavidin til opløsningen, er ændringer i J værdi observeret (figur 4C). Da biotin binder til streptavidin, det blå topintensiteten af PDA liposom (centreret ved ~ 645 nm i figur 1) blev faldet, mens en stigning i absorptionstop ved 540 nm observeret (F IGUR 1S). Figur 4D viser ændringer i FRET effektivitet. Den FRET effektivitet faldt med stigningen i streptavidin koncentration er også i overensstemmelse med vores forudsigelse.
Notér SR emission efter hver 40 pi alikvot tilsætning af streptavidin. Vi observerede en støt stigning i rhodamin emission efter tilsætning af streptavidin (figur 5). Denne forøgelse i rhodamin emission skyldes et fald i J værdi for Sulphorhodamine emissionsspektret og PDA absorbansspektrum efter biotin-streptavidin-vekselvirkninger. På det molekylære niveau fører de biotin-streptavidin-vekselvirkninger til små ændringer i den effektive konjugation længde af PDA hvilket resulterer i et fald i det blå-PDA form til en mere termodynamisk stabil rød-PDA form 2. Dette er grundlaget for ændringer i J-værdier. Interessant nok kan de små forskelle i de molekylære interaktioner for covalent eller ikke-covalent bundet biotin til PDA liposom probes ved hjælp af vores sensing assay 4.
Vi har også udført kontrolforsøg og har overvåget emission af kontrolprøverne under de samme eksperimentelle betingelser som dem for streptavidin-biotin-system. Kontrolforsøgene består af: (1) liposomopløsninger, der indeholdt biotin på deresoverfladen blev tilsat pufferopløsning med samme volumen og koncentration, og (2) Liposome opløsning uden biotin-receptorer på deres overflade blev der tilsat streptavidin af samme volumen og koncentration. Intensiteten af biotin-mærkede liposom opløsning efter tilsætning af streptavidin viste forøget intensitet men intensiteten af liposomet opløsning af kontrolforsøgene (for eksempel se fig 2S), på den anden side, en formindsket i emissionsintensiteten udstillet. Dette tilskrives fortyndingen af opløsningen. Disse forsøg viste tydeligt, at den forbedrede emission af opløsningen skyldtes specifikke molekylære interaktioner.
Forster radius (R 0) for rhodamin og PDA par beregnes (eq.2) til at være ~ 2,80 nm. Det betyder, at isolerede PDA-rhodamin par, vil 50% af den exciterede tilstand rhodamin molekyler har deres energi overført til PDA, når r er 2,80 nm.
Vi obs erved at når biotin er kovalent bundet til PDA backbone, emission stigning var 2-3 gange større end det ikke-covalent bundet biotin til liposomer. 4. Disse resultater antyder kraftigt, at vores foreslåede system er følsomt at skelne små forskelle i interaktionerne ved transduceren (linker mellem biotin og liposomdobbeltlag) på grund af kovalent og ikke-kovalent bundne receptorer bundet til liposomer. Afhængig af scanning og datafangst kapaciteter af spektrofotometer, real-time overvågning (i millisekund til anden tidsskala) af protein interaktioner (i UV-Vis spektroskopi) er muligt med denne sensing system.
Figur 1. Absorptionsspektra af blå og røde PDA løsninger. (Indsat) optiske mikrografer taget med et digitalt kamera.
g "/>
Figur 2. Reaktionsskema for PCDA-NHS-syntese (trin 1). Omsætning af PCDA-NHS til aminsubstituenten af proteiner (trin 2). Trin 2 er grundlaget for binding af lysinrest af proteiner til carboxylsyren med PCDA monomer. se større tal .
Figur 3A. Ændring i observerede FRET effektivitet skyldes ændringerne i absorptionsspektrum for PDA'en. Før polymerisation er der ingen overlapning mellem BSA-Rh emission og PDA absorption, men efter polymerisation PDA absorption overlapper med BSA-Rh emission, som er kravet for FRET. Rhodamin er en donor (rød) og polymeriserede PDA liposomer fungerer som en acceptor (blå).
Figur3B. Fluorescensspektre af BSA-Rh mærkede liposomer før (blå) og efter PCDA polymerisation (rød). En stor nedgang i rhodamin emissionen blev observeret på grund af FRET mellem rhodamin og PDA.
.. Figur 4A spektral overlapning (J) ændring til PDA (blå eller rød) absorptionsspektrum og Sulphorhodamine emissionsspektret (orange) Figur 4A er repræsentativt spektrum for ekstreme forhold, det vil sige, når et overskud af streptavidin blev tilsat til opløsningen. Figur 4A viser en næsten fuldstændig blue-to-red PDA transformation efter tilsætning af et overskud af streptavidin. Det ses tydeligt, at J (spektral overlapning) stiger med blå-skift af PDA absorptionsspektrum
Figur 4B. Fluorescensspektre før (blå) og efter (red) liposom polymerisation.
Figur 4C Betingelse for FRET:. J skift mellem donor (Sulphorhodamine) og acceptor (PDA) med streptavidin supplement til liposomets løsning.
Figur 4D. FRET effektivitsændring mellem donor (Sulphorhodamine) og acceptor (PDA) med streptavidin over liposomopløsningen.
Figur 5. Rhodamin emissionsspektret efter tilsætning af streptavidin-alikvoter til PDA liposomopløsningen. Nedfældning viser en større visning af emissionskvoter ændringer i SR-101 spektre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udført selektiv binding af lysinrest af protein på liposomoverfladen med NHS-amin reaktion. Dette FRET metode er i stand til at gøre Realtidsovervågning af biotin-streptavidin-binding og protein (BSA) binding til liposomoverfladen. Tilsvarende procedure kan anvendes til at studere de bindende dynamikken i forskellige protein-interaktioner med deres selektive receptorer. Der er fleksibilitet til at vælge fluoroforer, der vil give ændringer i J-værdier afhængig af de spektrale karakteristika for de fluoroforer. PDA er et universelt acceptor. Således er anvendelsen af PDA (acceptor) sammen med multiple fluoroforer og receptorer nævner muligheden for at give os flere sensorer. Følsomheden af vore sensorer er sub-nanomolær og med optimering, kan det blive yderligere styrket. Specificiteten af sensorerne er indstillet ved anvendelse af molekylære vekselvirkninger mellem receptorer og ligander. Disse sensorer kan også anvendes til større partikler sUCH som virus og bakterier.
Vi var også i stand til at indsamle værdifulde oplysninger som afstand mellem donor-acceptor, FRET effektivitet og J-værdi osv. Afstanden mellem donor og acceptor er beregnet til at være 2,8 nm. Dette var i overensstemmelse med vores forudsigelse. Da der er et stort behov for overvågning af lumske virus, bakterier og andre skadelige mikroorganismer, ønsker vi at fremstille en håndholdt enhed, der kan udføre real tid sensing af farlige biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til dette arbejde blev tilvejebragt gennem National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) og Orda på SIUC. Vi takker NSF om tilskud (CHE-0.959.568) for indkøb af en FE-SEM. Vi vil gerne takke professor Matthew McCarroll for personer diskussioner. Julia Reyes vil gerne takke COLCIENCIAS, Colombiansk Agency og Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia for hendes stipendium og finansiel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
