Summary
We tonen FRET tussen geconjugeerde polymeer polydiacetylene (PDA) en fluorofoor aan het oppervlak van liposomen PDA voor de detectie van biomoleculen. PDA liposomen bevatte receptor moleculen op hun oppervlak voor biomoleculen te worden gebruikt als probes. Ligand-receptor interacties leiden tot veranderingen in de FRET efficiency tussen de fluorofoor en PDA die de basis van de meetmechanismes.
Abstract
FRET is een proces waarbij energie niet radiatief overgebracht van een opgewonden donormolecuul een grondtoestand acceptor molecuul door lange afstand dipool-dipool interacties 1. In de onderhavige detectie assay, we gebruiken een interessante eigenschap van PDA: blauw-verschuiving van de UV-Vis-absorptiespectrum van elektronische PDA (figuur 1) na een analyt met receptoren aan PDA 2,3,4,7. Deze verschuiving in de PDA absorptiespectrum bepaald veranderingen in de spectrale overlap (J) tussen PDA (acceptor) en rhodamine (donor) die leidt tot veranderingen in de FRET efficiency. Aldus worden de interacties tussen analyt (ligand) en receptoren gedetecteerd door FRET tussen donorfluoroforen en PDA. In het bijzonder tonen we de detectie van een modeleiwit molecule streptavidine. We tonen ook de covalente binding-runderserumalbumine (BSA) het liposoomoppervlak met FRET-mechanisme. Deze interacties tussen thij dubbelgelaagde liposomen en eiwitmoleculen kunnen worden waargenomen in real-time. De voorgestelde methode is een algemene methode voor het detecteren van kleine chemische en biochemische grote moleculen. Aangezien fluorescentie intrinsiek gevoeliger dan colorimetrie, kan de detectielimiet van de bepaling in sub-nanomolaire gebied of lager 8. Verder PDA kan fungeren als een universele acceptor in FRET, waardoor meerdere sensoren kunnen worden ontwikkeld met PDA (acceptor) gefunctionaliseerd met donors en verschillende receptoren gehecht aan het oppervlak van liposomen PDA.
Protocol
A. Synthese en karakterisering van PDA Liposomen 4,5,6
Opmerking 1: Bescherm de PDA-oplossing tegen licht met behulp van aluminiumfolie wikkelen op elke container in alle experimentele stappen.
Opmerking 2: Twee verschillende sets liposoomoplossing (B en C) werden bereid volgens procedure A (Synthese en karakterisatie van liposomen PDA).
1. Synthese van N-hydroxysuccinimide Diacteylene (NHS-PCDA)
- Om liposomen te bereiden, is een essentieel ingrediënt PCDA-NHS vereist. We hebben gesynthetiseerd PCDA-NHS hand van de volgende procedure:
- Voeg 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hydroxysuccinimide (0,0914 g, 0,786 mmol) en 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (0,144 g, 0,713 mmol ) in droge CH2 Cl2 (20 ml).
- Roer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Verwijder voorzichtig het oplosmiddel met behulp van rOtary verdamper een droge dunne film opleveren.
- Gebruik scheidtrechter het residu extraheren met diethylether (25 ml) en water (25 ml) driemaal.
- Droog de organische laag met MgSO4 (1,0 g) gedurende een half uur. Filter en verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping om een witte vaste stof poeder (0,24 g,> 90%) te verkrijgen.
- Analyseren eindverbinding onder Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
- 1H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Liposoombereiding 5,6,7
- Los PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml dichloormethaan.
- Filtreer de oplossing met filtreerpapier om aggregaten te verwijderen.
- Volledig verdampen van het oplosmiddel om een dunne film van monomeren verkregen.
- Droog de dunne film gedurende de nacht onder vacuum.
- Hydrate de film met gedeïoniseerd water (50 ml) om een liposoomoplossing gewenste concentratie (0,65-1 mm) maken.
- Sonificeer de verkregen suspensie met een sonde-sonificeerinrichting bij 76 ° C voor ~ 18 min.
- Voorzichtig laat de oplossing door een papieren filter op de lipide aggregaten te verwijderen
- Koel de oplossing bij 4 ° C gedurende de nacht zelfassemblage van de monomeren te bevorderen. De uiteindelijke oplossing moet optisch helder.
- Polymeriseren de zelf samengestelde diëthyn monomeren (liposoom) door bestraling met 254 nm UV-straling tot 2 minuten met een Pen Ray UV bron (4,5 mW / cm 2) in lucht.
- De liposoomoplossing was stabiel bij kamertemperatuur gedurende ten minste twee weken. De oplossing was stabiel gekoeld.
B. Bereiding van Rhodamine-gelabeld Bovine Serum Albumine (BSA-Rh) PCDA gemodificeerde liposomen
1. Binding van BSA-Rh het liposoomoppervlak
- Los BSA in PBS-Rh buffer (ionische concentratie 0,01 M, pH 7,2) tot de eindconcentratie van 1,2 uM van BSA Rhodamine-oplossing.
- Voeg 2 ml (1,2 uM) van BSA-Rhodamine met 10 ml liposoomoplossing bereid in stap A.2. (Zie hierboven) bij kamertemperatuur.
- Klassieke reactie voor de binding van aminegroepen van de lysinerest van eiwitten carbonzuur geactiveerd door NHS groep is gevolgd (Reactieschema in figuur 2). NHS-PCDA is gemaakt (Figuur 2, stap 1) voor het covalent binding eiwitmoleculen met liposomen met NHS-amine reacties (Figuur 2, Stap 2). NHS is een uitstekend verlaten middel dat de amine-carbonzuur reactie in voorwaartse richting rijdt. De opbrengst van deze reactie onder adequate omstandigheden moet kwantitatief.
- Verwijdering van vrije BSA-Rh: Drenk een Spectra / Por Biotech cellulose-ester (CE) membraan (MW C O: 100.000) in gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten. Dit membraan wordt gebruikt voor dialyse ongereageerd BSA Rhodamine-(Molecuulgewicht ~ 66.000 Da) in gedeïoniseerd water.
- Breng voorzichtig de oplossing in het dialysemembraan.
- Verander het water 2 uur, 8 uur, 14 uur, 24 uur en 36 uur tijdens dialyse.
- Verzamel de uiteindelijke oplossing in een injectieflacon met aluminiumfolie.
C. Bereiding van SR-diamine en biotine-gelabelde liposomen
1. In plaats van DMPC in stap 2.1, zullen we biotine gemerkt-(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl) (biotine-DOPE).
- Volg alle stappen door middel van 2,2 tot 2,9.
- In plaats van BSA-Rh in stap B, gebruik Diamine getagd sulphordodamine (SR-diamine).
- Volg alle verdere stappen in B.
- De liposomen in dit preparaat die biotine en SR-diamine op hun oppervlak. Volgende stappen waren gelijk aan A en B (zie hierboven) met een uitzondering: streptavidine werd aan de solutiaan biotine-streptavidine interacties te onderzoeken door veranderingen in de FRET efficiency.
D. Representatieve resultaten
Titelfiguur. Een cartoon uitleggen van de reactie en FRET dat plaatsvindt liposoomoppervlak (bereid door stap B).
A. Controle van de eiwitten gehechtheid aan liposomen met behulp van FRET 1
Monitoring van FRET tussen Rhodamine en PDA liposomen bereid in stap B.
Excitatie en emissie spectra van BSA-Rh en absorptiespectrum van PDA genomen (Figuur 3A). We kunnen duidelijk zien dat het emissiespectrum van BSA-Rh overlapt met het absorptiespectrum van PDA. Deze voldoet aan de eis dat de resonantie FRET-mechanisme. BSA Rhodamine-gelabeld liposomen voor en na polymerisatie werden geanalyseerd met UV-Vis en fluorescentiespectroscopie. Voor de geïsoleerde donor en acceptor, de FRET efficiëntie sterk afhankelijk van donor-acceptor afstand (r) en J 1 (j-waarde). De uitdoving van de emissie wordt waargenomen (Figuur 3B) vanwege FRET tussen rhodamine en PDA door het verschijnen van elektronische absorptiespectrum van blauwe PDA na fotopolymerisatie. In ons geval FRET efficiëntie nul gepolymeriseerd liposomen en Rhodamine omdat J = 0 voor ongepolymeriseerde liposomen in het zichtbare gebied.
We vergelijkbare experimenten uitgevoerd met slechts PDA liposomen die niet bevatten NHS op hun oppervlak. In deze gevallen werd BSA-Rh niet gekoppeld aan de oppervlakte van de liposomen. In dat geval is de gemiddelde afstand tussen rhodamine en PDA (r gemiddeld) was veel groter dan Forster radius (R 0 = 2,8 nm). Daarom hebben we niet zien een sterke afname van de fluorescentie-intensiteit. Deze waarneming wordt eenlso suggereert dat de fluorescentiedoving dominant is als r <2,8 nm.
J en R 0 waarden werden berekend met volgende formule: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0.211 [k 2 N-4 Q J D (λ)] 1/6
De extinctiecoëfficiënt (ε) van blauw-PDA in het traject van 2000 tot 10.000 M-1 ~ cm -1 voorafgaand aan toevoeging van streptavidine. De extinctiecoëfficiënt van blue-PDA is afhankelijk van de foto-polymerisatie toestand. [2] Bijvoorbeeld, ε waarden groter voor een oplossing die werd gepolymeriseerd langer. Verder kan de zelf-assemblage van het diëthyn monomeren beïnvloeden ook de ε waarden. De J calculaties rekening te houden met deze veranderingen, en zij rekening gehouden met wijzigingen in de PDA extinctiecoëfficiënten als gevolg van biotine-streptavidine moleculaire interacties. J waarden worden berekend met behulp van experimentele PDA absorptie en SR-101 emissiegegevens. De veranderingen in de J waarden door verschuiving in de elektronische absorptiespectrum van PDA na toevoeging van streptavidine aan de oplossing (Figuur 4C). De eenheid van J waarden M-1 cm-1 nm 4.
B. Monitoring van FRET met toevoeging van streptavidine de biotine gemerkt liposoomoplossing
Opmerking 1: Monitoring van FRET tussen Rhodamine en PDA liposomen bereid in stap C hierboven.
Excitatie en emissie spectra van sulphordodamine-gelabeld diamine (SR-diamine) en absorptiespectrum van PDA genomen (Figuur 4A). Gepolymeriseerd en gepolymeriseerd biotine gelabelde liposomen werden geanalyseerd met UV-Visen fluorescentie spectroscopie. De emissie van rhodamine (SR-101) wordt met ongeveer 45% na polymerisatie (Figuur 4B) suggereert emissie quenching door FRET. Voeg 40 ul aliquots (1 uM) van streptavidine oplossing 2 ml van liposoomoplossing. Met de toevoeging van streptavidine aan de oplossing wordt veranderingen in J waarde waargenomen (Figuur 4C). Zoals biotine bindt aan streptavidine, de blauwe piekintensiteit van PDA liposoom (gecentreerd op ~ 645 nm in Figuur 1) werd verlaagd dat een verhoging van de absorptiepiek bij 540 nm wordt waargenomen (F igure 1S). Figuur 4D toont veranderingen in de FRET efficiency. De FRET efficiency af met de toename van de concentratie streptavidine ook consistent met onze voorspelling.
Noteer de SR emissie na elke 40 pi aliquot toevoeging van streptavidine. We zagen een gestage toename van het rhodamine emissie na de toevoeging van streptavidine (Figuur 5). Deze toename in rhodamine emissie wordt veroorzaakt door een daling van de waarde voor de J sulphordodamine emissiespectrum en PDA absorptiespectrum na biotine-streptavidine wisselwerkingen. Op moleculair niveau, de biotine-streptavidine interacties leiden tot kleine veranderingen in de effectieve lengte van de conjugatie PDA waardoor een afname in het blauw PDA formulier een thermodynamisch stabiele vorm rode PDA 2. Dit is de basis van veranderingen in J waarden. Interessant is dat de subtiele verschillen in de moleculaire interacties covalent of niet-covalent gebonden biotine PDA liposoom worden gehybridiseerd met onze detectie assay 4.
We hebben eveneens de controle-experimenten hebben en bewaakt de emissie van de controlemonsters onder dezelfde experimentele omstandigheden als voor streptavidine-biotine systeem. De controle experimenten bestaan uit: (1) Liposome oplossingen die op hun biotineoppervlak werden bufferoplossing van hetzelfde volume en concentratie, en (2) liposoomoplossing zonder biotine receptoren op hun oppervlak werden streptavidine van hetzelfde volume en concentratie. De intensiteit van de biotine-gelabeld liposoom oplossing na toevoeging van streptavidine toonde verhoogde intensiteit maar de intensiteit van de liposoomoplossing van de controle-experimenten (bijvoorbeeld zie Figuur 2S) daarentegen, vertoonden een verminderde emissie-intensiteit in. Dit wordt toegeschreven aan verdunning van de oplossing. Deze experimenten toonden duidelijk aan dat de verhoogde emissie van de oplossing door specifieke moleculaire interacties.
Forster radius (R 0) voor rhodamine en PDA paar wordt berekend (eq.2) te zijn ~ 2,80 nm. Dit betekent dat voor geïsoleerde PDA-rhodamine paar, 50% van de aangeslagen toestand rhodamine moleculen hun energie naar PDA hebben wanneer r is 2,80 nm.
We obs erved dat wanneer biotine covalent is gebonden aan de ruggengraat PDA, de emissie stijging 2-3 keer groter dan die van niet-covalent gebonden biotine aan liposomen. 4 Deze resultaten suggereren sterk dat ons voorgestelde systeem is gevoelig voor kleine verschillen in de interacties onderscheiden de transducer (linker tussen biotine en liposoom bilaag) door covalent en niet-covalent gebonden receptoren aan liposomen. Afhankelijk van het scannen en data acquisitie mogelijkheden van de spectrofotometer, real-time monitoring (in milliseconde tot tweede schaal) van eiwit interacties (in het UV-Vis-spectroscopie) is mogelijk met deze sensorsysteem.
Figuur 1. Absorptiespectra van blauwe en rode PDA oplossingen. (Inzet) optische microfoto gemaakt met een digitale camera.
g "/>
Figuur 2. Reactieschema voor de synthese PCDA-NHS (stap 1). Reactie van PCDA-NHS de amine substituent van eiwitten (stap 2). Stap 2 is de basis van binding van lysinerest van eiwitten aan het carbonzuur PCDA monomeer. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 3A. Verandering in waargenomen FRET efficiëntie door de veranderingen in het absorptiespectrum van de PDA. Voor polymerisatie er geen overlap tussen BSA-Rh emissie en absorptie PDA maar na polymerisatie PDA absorptie overlapt met BSA-Rh straling met de vereiste FRET. Rhodamine een donor (rood) en gepolymeriseerde PDA liposomen als een acceptor (blauw).
Figuur3B. Fluorescentie spectra van BSA-Rh gelabeld liposomen voor (blauw) en na polymerisatie PCDA (rood). Een sterke afname van de rhodamine-emissie werd waargenomen door FRET tussen rhodamine en PDA.
.. Figuur 4A spectrale overlap (J) verandering PDA (blauw of rood) absorptiespectrum en sulphordodamine emissiespectrum (oranje) Figuur 4A is de vertegenwoordiger spectrum voor extreme toestand, dat wil zeggen wanneer een overmaat van streptavidine werd aan de oplossing toegevoegd. Figuur 4A toont een bijna volledige blauw-naar-rood PDA transformatie na toevoeging van een overmaat streptavidine. Het is duidelijk te zien dat J (spectrale overlap) neemt blauw-verschuiving van de PDA absorptiespectrum
Figuur 4B. Fluorescentiespectra voor (blauw) en na (red) liposoom polymerisatie.
Figuur 4C Voorwaarde voor FRET:. J verandering tussen donor (sulphordodamine) en acceptor (PDA) met streptavidine Naast de liposoomoplossing.
Figuur 4D. FRET efficiency verandering tussen de donor (sulphordodamine) en acceptor (PDA) met streptavidine Naast de liposoomoplossing.
Figuur 5. Rhodamine emissiespectrum na toevoeging van streptavidine aliquots de PDA liposoomoplossing. Inzet toont een grotere weergave van de emissie veranderingen in de SR-101 spectra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben selectieve binding van lysinerest van eiwit op liposoomoppervlak met NHS-amine reactie. Deze FRET gebaseerde methode in staat is van het doen van Real-time monitoring van biotine-streptavidine binding en eiwitten (BSA) binding aan het liposoom oppervlak. Soortgelijke procedure kan worden toegepast om de binding van verschillende dynamiek eiwit interacties met hun selectieve receotiren. Er flexibiliteit in het kiezen van fluoroforen die zullen veranderingen in de J waarden afhankelijk van de spectrale kenmerken van de fluoroforen. PDA is een universele acceptor. Daarom wordt het gebruik van PDA (acceptor) met meerdere fluoroforen en receptoren verhoogt de mogelijkheid om ons meerdere sensoren. De gevoeligheid van de sensoren sub-nanomolaire met optimalisatie, kan worden versterkt. De specificiteit van de sensors wordt afgestemd door middel van moleculaire interacties tussen receptoren en liganden. Deze sensoren kunnen ook worden gebruikt voor grotere deeltjes sUCH zoals virussen en bacteriën.
We waren ook in staat om waardevolle informatie te verzamelen als afstand tussen donor-acceptor, FRET efficiëntie en J-waarde enz. De afstand tussen de donor en acceptor is berekend op 2,8 nm. Dit kwam overeen met onze voorspelling. Omdat er een grote behoefte aan controle van de verraderlijke virussen, bacteriën en andere schadelijke micro-organismen, willen we een hand held apparaat dat kan uitvoeren real-time detectie van gevaarlijke biomoleculen produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door de National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) en ORDA op SIUC. Wij danken NSF voor een subsidie (CHE-0959568) voor de aankoop van een FE-SEM. We willen graag prof. Matthew McCarroll bedanken voor nuttige discussies. Julia Reyes zal graag COLCIENCIAS, Colombiaanse Agentschap en Universidad Pedagogica y Tecnológica de Colombia bedanken voor haar beurs en financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
