Summary
Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.
Abstract
Bu protokol Arabidopsis fidelerinin bir floresan mikroskop tabanlı tarama açıklanır ve sekretuar yolun belirli bir etiketli floresan marker Subselüler dağılımını değiştirebilir resesif mutasyonlar eşlemek anlatılmaktadır. Arabidopsis nedeniyle genom büyüklüğü genetik çalışmalar için güçlü bir biyolojik model, nesil zaman ve krallıkları arasında moleküler mekanizmaları korunması. Moleküler belirteçler dayalı geleneksel yönteme alternatif olarak mutasyon eşlemek için bir yaklaşım olarak genotipleme dizi nispeten hızlı olduğu için avantajlı olduğunu ve gerçekten çok kısa süre içerisinde birçok mutantların haritalama izin verebilir. Bu yöntem, bitkilerde herhangi bir organelidir bütünlüğünü etkileyebilir proteinlerin tanımlama sağlar. Burada bir örnek olarak, endoplazmik retikulum (ER) bütünlüğü için önemli gen haritası için bir ekran öneriyoruz. Bizim yaklaşımımız, ancak kolayca diğer bitki hücre organelleri uzatılabilir(Örneğin 1,2 bakınız), ve böylece diğer hücre içi yapıları düzenleyen moleküler temelini anlamaya yönelik önemli bir adımı temsil etmektedir.
Protocol
1. EMS Tedavi
Arabidopsis thaliana tohumu T / A mutasyonlar 5-7 C / G elde genomunun C-etmek-T içinde değişikliklerin indüklemektedir mutajen madde etil metan sülfonat (EMS) 3,4 olarak kullanılarak mutagenized edilir.
- Organel floresan işaretleyici (özellikle, bu çalışmada ssGFPHDEL (sinyal sekansı-GFP-HDEL tetrapeptide) bir ER belirteç olarak kullanılmıştır) taşıyan 0.8 g Arabidopsis tohumları (~ 40.000 tohum) tartılır.
- 50 ml falcon tüp tohumları aktarın, sonra 25 ml saf su ekleyin.
- % 0.2 (v / v) etil metan sülfonat ekleyin.
- Düşük hızda karıştırıcı nutating 16 saat boyunca inkübe.
- Sıvı aspire ve 1.0 M NaOH EMS inaktive içeren bir şişeye içine atın.
- Yakın, tohum içeren Falcon tüpüne 25 ml su ekleyin ve 5 kez ters tohum yıkamak, tüm tohumları çökene kadar bekleyin, sonra 1.0 M Na içine su aspire ve atın Şişesi OH.
- 10 kata kadar yıkama işlemi tekrarlayın.
- Nihai yıkamadan sonra, su minimal miktarda tohumların yeniden askıya.
- % 10 çamaşır suyu 25 ml ekleyerek tohum sterilizasyon geçin, 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. Daha sonra çamaşır suyu dökünüz ve steril su 25 ml ile yıkayın, tohumlar dibe edelim. Steril suyu dökün ve 25 ml% 70 etanol ekleyin. 30 s için tüpleri çalkalayın. Tohumlar dibe edelim. Etanol kapalı dökün ve steril su 25 ml ile yıkayın. Sonra 3 MM filtre kağıdı içeren plastik Petri tabağına tohumları dökün ve kaputun altında kurumaya bırakın, iki kez steril su ile yıkama tekrarlayın. 2 gün süre ile 4 ° C'de muhafaza edilmelidir.
- ½ MS phytagel (Murashige ve Skoog orta yarısı konsantrasyonu), 150 mm petri (plaka için ~ 250-300 tohumları) üzerine Plaka tohumları.
- 2 hafta için plaka üzerinde M1 tohumlar büyüyecek, daha sonra toprağa nakli.
- M2 hatları (1000 bağımsız hat) oluşturmak için bireysel M1 bitkilerden M2 tohumlar toplayın.
Bu bölümde daha önce 8 açıklandığı gibi bir konfokal veya floresan mikroskobu ile fide gözlem açıklar.
- Her M2 hattan altmış tohumları plastik Petri, 7 ila 10 gün, ½ MS phytagel için yetiştirilen; aynı plaka üzerinde de (kontrol), EMS-tedavi edilmemiş 5 fideleri yetiştirilmektedir.
- Beş on kotiledon bir mikroskop lamı üzerine objektif (40X) doğru eksen dışı tarafı ile monte edilmiş ve bir coverslip ile birlikte verilmektedir.
- Her kotiledon organelidir işaretleyici her değişmiş Subselüler dağıtılması için floresans altında, kortikal gelen medyal bölgeye, görülmektedir.
- Pozitif bitkiler toprak nakil vardır ve bunların tohumları toplanır ve M3 nesil mutant fenotip onaylamak için tekrar taranmaktadır.
- Muhtemelen birlikte bir yabani tip genomuna backcrossing yoluyla mutasyonlar arka kirletici en az üç kez çıkarınİstediğiniz organel floresan işaretleyici ntaining.
- Anne bitki, ince makas veya forseps kullanarak olgun siliques kaldırmak ve açık çiçekler.
- Meristemlerinde çok küçük tomurcuklar çıkarın.
- Yaprakları ve bir çiçek tomurcuğu açın ve tüm anter kaldırmak için çanak yaprakları arasında forseps bir çift ucu yerleştirin.
- Forseps bir çift kullanarak baba bitki açık bir olgun çiçek alıp hadım bitkinin tepeciklerdeki anter ovalayın.
3. Haritalama
Bu bölümde, geleneksel haritalama yöntemleri 10,11 ile kıyaslandığında daha hızlı Borevitz 9 değiştirilmiş bir protokolü kullanan bir resesif mutasyon eşlemek aslında açıklamaktadır. Bu yaklaşım tek bir tahlil 12 sayısız tek özelliği polimorfizmleri (SFP) tespit etme yeteneğine sahip yüksek yoğunluklu oligonükleotid diziler kullanın. Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip dizi kullanmak mümkünyaklaşık 24.000 gen analiz. Mutasyon gösteren F 2 bireylerin bir havuz aynı ayırma nüfus içinde toplanan yabani tip F 2 bitkilerin bir havuz ile karşılaştırılır. Daha sonra, mutasyon mutant havuzu mutant genotip allelleri için zenginleştirilmiş bölgede eşlenecek ve dolayısıyla aynı bölgede yabani tip havuzu vahşi tip üst allelleri 13 zenginleştirilmiş sonuçlanacaktır.
- Genomik DNA (3 mg) bir Qiagen DNeasy Bitki Mini Kit kullanılarak homozigot mutant Columbia (M3) elde edilir ve Illumina Genom Analyzer II (GA II) 14 sıralaması için sunulmuştur.
- Homozigot mutant Columbia (M3) bir eşleme nüfus üretmek için Landsberg erecta ile çarpı işareti vardır.
- Haritalama anormal fenotip ve vahşi tip fenotipi ile F2 bitkilerin aynı sayıda gösteren 70 kadar 100 F2 bireyler üzerinde yapılır.
- Bir delik açma kullanarak yaprak disk her bitki (0,60 mm) toplayın.yaprak disk DNA benzer miktarda olduğundan emin olmak için aynı yaştaki yapraklarından elde toplanmalıdır. Örnekler genomik ekstraksiyon ayrı ayrı veya gruplar için işlenebilir. Bu durumda, bu sonuçta bir genomik DNA elde edilmesi için olan hangi az Eppendorf tüpler sahip olacak şekilde her bir Eppendorf tüpüne için 5-10 örnekleri toplamak mümkündür.
- MasterPure Bitki Yaprak DNA izolasyon kiti (Epicentre) genomik DNA elde etmek için kullanılmaktadır. Her bir numune elde edilen bir genomik DNA nanodrop ile ölçülür.
- Her örnek genomik DNA aynı miktar daha sonra bitki DNA'ların 300 ng (~ 30 uL) toplam kadar birlikte alınır; 60 uL 2.5X rastgele primerler çözümü eklemek [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanol, 750 ug / ml oligodeoksiribonükleotid primerler (rastgele octamers)] (Bioprime kiti) ve 42 uL su (nihai hacim 132 uL).
- Denatüre> 95 ° C de DNA'lar 5-10 dakika için.
- Buz üzerinde serin.
- Her denatu içinkırmızı bir DNA Biotin dCTP [1 mM biyotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, dGTP 2 mM, 10 mM Tris-HCl içinde 2 mM dTTP (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] ile 15 uL 10X dNTP karıştırılır (Bioprime kiti) ve 3 uL Klenow polimeraz (Bioprime kiti) ile tamamlamak.
- 25 ° C'de bir gece boyunca inkübe
- Karması; Ertesi gün, 15 uL 3 M NaOAc ve 400 uL soğuk% 100 EtOH ekleyin.
- 1 saat -80 ° C'de inkübe edin, sonra 15 dakika 20,500 xg'de spin süpernatant kaldırmak ve 500 uL soğuk% 75 EtOH ile yıkayın.
- 10 dakika süreyle 20,500 x g'de dönerler.
- 100 uL su içinde 10 dakika ve Pastör pipetiyle için 37 ° C'da kuru bir DNA peletleri.
- Bir jel (Şekil 2) verim ve kalite kontrol etmek için 5 uL kullanın.
- Için yabani tip ve mutant GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array Hibridizasyon için reaksiyon etiketleme 95 uL gönder.
- R yazılım (kullanarak diziler taranır ve elde. CEL dosyaları analiz edilir http://www.r-project.org /).
- R yazılımı yükleyin, sonra programı açın ve aşağıdaki dize yapıştırın:
kaynağı (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Sonra geri dönüş tuşu-Bu standart Bioconductor paketleri (kuracaktır basın http://www.bioconductor.org ). - Masaüstünde yeni bir klasör, aşağıdaki web sitesinden (indirdiğiniz http://www.naturalvariation.org/methods ) dosyaları:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
Dosya ColLerCEL.zip ambalajsız ve sonuç dosyaları yeni klasöre yapıştırılır. - Wildtype.CEL ve mutant.CEL içine GeneChip deneyden elde edilen veriler yeniden adlandırın.
- Lütfen GeneChip veriler artık kopyalayın (wildtype.CEL veKlasör içine mutant.CEL).
- Açık R, Mac için): ardından "Çeşitli" ve "Değişim çalışma dizini" seçeneğine tıklayın. b) PC için: tıklayın "Dosya" ardından "Değişim dizini"
- Mac için: a) dosyalarını içeren klasörü seçin. "Çalışma Alanı", "Yük çalışma alanı dosyasını tıklatın:" sonra "Dosya, Yük çalışma alanı" "PC için basıp ath1V5.RData, b) Yukarıda dosyalarını içeren klasörü seçin," ve ath1V5.RData seçin.
- Açık readCEL.R Not Defteri'ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak
- Açık SFP.R Not Defteri'ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak
- Açık Map.R Not Defteri'ni kullanarak ve R. için tüm metni kopyalamak
- Konsol penceresinde aşağıdaki iletiyi görürsünüz:
Kromozom x Mb yz sınırlar
TAIR arayın genleri bu linki yapıştırın
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=yVe sonunda = z - İnternet tarayıcınıza linki kopyalayıp yapıştırın. Bir pencere açılacak ve dosyayı açmak veya kaydetmek için sorar; kaydetmek seçmelisiniz. Bir dosya adı seçin ve uzantısı ekleyiniz ". Xls" Kaydet öğesini tıklatın.
- Bu dosyayı açmaya Eğer mutant için koordinat (sonucu grafiksel Şekil 3'te temsil edilir) bulabilir ". Xls".
- Monte Illumina olduğu eşleşen alanı içinde mutant genomunun okur tek nükleotid polimorfizmleri arasında belli EMS geçişler 4 tanımlamak. Standart prosedürler kullanılarak 15 vahşi tip gen (ler) ile dönüşümün mutant fenotip tamamlar.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 konfokal mikroskopi kullanılarak tarama sekretuar yolunun bir mutant belirlenmesi için kullanılan bir yaklaşım göstermektedir. Şekil 2 dizi hibridizasyon için etiketli genomik DNA tipik bir hazırlık gösterir. Şekil 3, GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array elde edilen veriler sunulmuştur analiz ettikten sonra beklenen tipik bir sonucu olarak.
SsGFPHDEL (ER işaretleyici) (1) ifade Şekil 1. Arabidopsis transgenik EMS muamele tesislerinde (2) için yeterli tohum üretmek için yetiştirildi. EMS ile muamele edilen tohumlarda sonra M1 bitkilerinin (3) oluşturmak için ekilmiştir. Her M1 bitki farklı bir çizgi temsil eder ve tohum her birinden ayrı ayrı toplandı. M2 tohum ½ MS substrat (4) üzerine kaplama ve sonra konfokal mikroskopi (5) ile ER morfolojisi kusurlar için tarandı. Tarama sırasında biz yabani tip ER morfolojisi (6) ve kusurlu ER fenotipleri (7) göstermek bitkiler ve koruyan bitkiler bulundu. Bu bitkiler M3 nesli elde etmek ve fenotipi (8) onaylamak için yetiştirilmiştir. M3 bitki genomik DNA sekanslama Solexa Illumina (a) için kullanıldı. Aynı bitkiAyrıca, F2 eşleme nüfusu (b) elde etmek için Ler-WT ile melezleme için kullanılmıştır.
Şekil 2,. Bioprime rastgele etiketleme reaksiyonları (100 uL 5 ul) 1 agaroz jel% üzerine yüklendi. Lane vahşi tip F2 bitkilerin bir havuzdan ve şerit b mutant F2 bitkilerin bir havuz değil. (Marker NEB gelen, 1 Kb DNA merdiveni-N3232) olduğunu.
Şekil 3. Şekil GeneChip Arabidopsis ATH1 Genom Array Hibridizasyon kullanarak Col-0 mutasyon eşleme örneği temsil eder. Bu örnekte mutasyonu dikey çubuklarla kromozom 1, sınırlandırılmış bulunmaktadır. Yatay çubuklar tespiti için eşiklerin temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada endomembrane mutantların tanımlanması için bir konfokal mikroskopi tabanlı tarama nitelendirdi. Bu yaklaşım kolaylıkla spesifik floresan protein belirteçler mevcut olduğu hücrenin diğer organelleri kadar uzatılabilir. Ekran hedef organel veya işaretleyici içeren gerekiyordu değil organeller için ya floresan işaretleyici bir anormal dağılım gösteren mutantların tanımlanması dayanmaktadır. Sırasıyla, bu mutantlar işaretleyici subcompartimentalize için organel yeteneği ya tehlikeye düşer, aldığı nüfus veya düzgün organeller arasında işaretleyici transloke olamaz mutantlar temsil eder. Tarama sırasında bazı mutantlar erken 7 gün çimlenme sonrası gibi erken gelişim dönemlerinde bir fenotip gösterdikleri, ancak diğerleri sadece gelişme daha sonraki bir aşamasında fenotip gösterdi. Bu mutasyona uğramış gelişimi bağımlı ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle, bağlı olsa daalleli (ler), bu bitkilerin potansiyel olarak ilginç mutantlar atılır olmadığını garanti etmek (en az 7 ila 14 gün) farklı büyüme safhalarında incelenmesi gerektiğini göstermektedir.
Bu protokolün açıklanan yaklaşım bize klasik haritalama yöntemi ile karşılaştırıldığında oldukça kısa bir zaman içinde bir gen haritası sağlar. Aslında, GeneChip Array için kullanılan F2 nüfusun bireyler yeterli sayıda toplama klasik ince eşleştirme işlemi için gerekli olan F2 bitkilerine kıyasla nispeten az miktarda zaman gerektirir. Ancak, dikkat edilmesi gereken önemli adımlar vardır. F2 nüfus örnekleri gösteren veya fenotip gösteren seçimi nihai sonucu içine hataları tanıtabilirsiniz yanlışlıkla fenotipe sahip bitkiler bile az sayıda ek beri, dikkatle yapılmalıdır. Bu, daha çok pürüzlü eşleme için kullanılan F2 nüfusu çok küçük olması ile bağlantılıdır. Bu nedenle, bu bitkilerin seçimi EITOnu göstermek veya fenotip çimlenme sonrası aynı gün her zaman yapılmalıdır görünmüyor. Yukarıda da belirtildiği gibi, fenotip görünüşünü büyümesi ile bağlantılı olabilir, çünkü. Bir başka önemli nokta bize varyant içeren okur yüzdesi gibi önemli bilgiler vermek programlar tarafından oluşturulan yeni nesil veri postalignment, dikkatlice bakmaktır. Heterozigot varyant beklenen teorik değeri% 50 civarındadır, bu bir homozigot varyant için,% 100 dolaylarında iken dizileri% 50 varyant içeren demektir. Ne yazık ki bir postalignment sonra durumun, teorik değerden uzak olabilir aslında heterozigot varyant içeren okur yüzde 20 ila% 80 homozigot 16 100 60 arası ise% değişebilir. Bu nedenle, sırayla kilit tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) kaçırmamak, yeniden az% 100 oranı ile mutantlar atmamayı önemlidirvaryantı için reklamlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Kimyasal Bilimler, Yer Bilimleri ve Biyolojik Bilimler Bölümü, Temel Enerji Bilimler, Fen Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı (ödül sayısı DE-FG02-91ER20021) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB 0.948.584) (FB) Müdürlüğü tarafından destek için minnettarım. Biz yazının düzenleme için Bayan Karen Kuş minnet borçluyuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K.
- Maple, J., Moller, S. G.
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
