Summary
Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.
Abstract
Dit protocol beschrijft een fluorescentie microscoop op basis van screening van Arabidopsis zaailingen en beschrijft hoe in kaart te brengen recessieve mutaties die de subcellulaire distributie van een specifiek gelabeld fluorescente marker in de secretieroute te wijzigen. Arabidopsis is een krachtig biologisch model voor genetisch onderzoek vanwege de grootte van het genoom, generatietijd, en behoud van de moleculaire mechanismen onder de koninkrijken. De array genotypering als een benadering van de mutatie in kaart te brengen alternatief voor de traditionele methode op basis van moleculaire merkers is voordelig omdat het relatief sneller en kunnen aan het in kaart brengen van de verschillende mutanten in een heel kort tijdsbestek. Deze methode maakt het mogelijk de identificatie van eiwitten die de integriteit van de organellen in planten kunnen beïnvloeden. Hier, als voorbeeld, stellen we een scherm om de kaart te genen die belangrijk zijn voor de integriteit van het endoplasmatisch reticulum (ER). Onze aanpak is echter gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten celorganellen(Zie bijvoorbeeld 1,2), en dus een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van de moleculaire basis gelden voor andere subcellulaire structuren.
Protocol
1. EMS behandeling
Arabidopsis thaliana zaden worden gemutageniseerd gebruiken is als mutageen middel ethylmethaansulfonaat (EMS) 3,4, die induceert in het genoom C-to-T-veranderingen als gevolg van C / G op T / A mutaties 5-7.
- Weeg 0,8 g Arabidopsis zaden (~ 40.000 zaden) het dragen van de organel fluorescente merker (in het bijzonder, in deze studie ssGFPHDEL (signaalsequentie-GFP-HDEL tetrapeptide) is gebruikt als een ER-marker).
- Breng de zaden in een 50 ml falcon buis, voeg dan 25 ml gedestilleerd water.
- Voeg 0,2% (v / v) ethylmethaansulfonaat.
- Incubeer gedurende 16 uur op nutating mixer op lage snelheid.
- Zuig de vloeistof en gooi het in een kolf met 1,0 M NaOH aan het EMS te inactiveren.
- Voeg 25 ml water aan de Falcon buis met de zaden, in de buurt, en invertsuiker 5 keer om de zaden te wassen, en wacht totdat alle zaden hebben gevestigd, dan zuigen het water en gooi in de 1,0 M Na OH kolf.
- Herhaal de wasstap tot 10 keer.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de zaden in een minimale hoeveelheid water.
- Ga verder met zaad sterilisatie toevoeging van 25 ml van 10% bleekwater, schud krachtig gedurende 30 s. Laat zaden af te wikkelen naar beneden, en giet dan af bleekmiddel en spoel met 25 ml steriel water. Giet het steriele water en voeg 25 ml 70% ethanol. Schudden buizen 30 s. Laat zaden af te wikkelen naar beneden. Giet af en spoel ethanol met 25 ml steriel water. Herhaal twee keer wassen met steriel water, dan zaden giet op een plastic petrischaal met daarin 3 MM filter papier en droog onder de kap te laten. Bewaren bij 4 ° C gedurende 2 dagen.
- Plaat de zaden op ½ MS phytagel (de helft concentratie van Murashige en Skoog medium), 150-mm Petri-schaal (~ 250-300 zaden voor plaat).
- Grow M1 zaden op de plaat gedurende 2 weken, dan transplanteren in de ondergrond.
- Verzamelen M2 zaden van individuele planten M1 M2 lijnen (1.000 onafhankelijke lijnen) genereren.
In deze paragraaf beschrijven we de observatie van zaailingen met een confocale fluorescentiemicroscoop of zoals eerder 8 beschreven.
- Zestig zaden van elke M2 lijn worden geteeld voor 7 tot 10 dagen op plastic petrischaaltjes, ½ MS phytagel, op dezelfde plaat worden ook verbouwd 5 zaailingen EMS-onbehandelde (controle).
- Vijf tot tien zaadlobben zijn gemonteerd met de abaxiale zijde naar de lens (40X) op een microscoopglaasje en afgesloten met een dekglaasje.
- Elke cotyledon wordt waargenomen, de corticale de mediale gebied, onder fluorescentie voor veranderde subcellulaire verdeling van de organellen marker.
- Positieve planten worden getransplanteerd in de bodem en hun zaden worden verzameld en opnieuw gescreend om het mutante fenotype van de M3 generatie te bevestigen.
- Verwijder de vervuilende achtergrond mutaties door middel van terugkruising ten minste drie keer aan een wild-type genoom mogelijk samenntaining de gewenste organel fluorescente merker.
- Van de moederplant, met behulp van fijne schaar of pincet te verwijderen volwassen siliques, en open bloemen.
- Verwijder de knoppen die te klein zijn van het meristeem.
- Steek de punt van een pincet tussen de bloemblaadjes en de kelk aan een bloemknop te openen en verwijder alle helmknoppen.
- Met behulp van een pincet te nemen een open rijpe bloem van de vader plant en wrijf de helmknoppen op de stempel van de ontmand plant.
3. Mapping
Dit hoofdstuk beschrijft hoe in wezen in kaart te brengen een recessieve mutatie met behulp van een gemodificeerde protocol van Borevitz 9, die is sneller als in vergelijking met traditionele methoden in kaart brengen van 10,11. Deze benadering de hoge-dichtheid oligonucleotide arrays met het vermogen om veel enkel kenmerk polymorfismen (SFP) detecteren in een enkele test 12. De Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip matrix mogelijk isanalyseren van ongeveer 24.000 genen. Een pool van F 2 personen die de mutatie wordt vergeleken met een pool van wild-type F 2 planten verzameld binnen dezelfde splitsende populatie. Vervolgens wordt de mutatie in kaart worden gebracht in de regio waar de mutant zwembad is verrijkt voor mutant genotype allelen en dus in dezelfde regio het wild-type zwembad zal resulteren verrijkt voor het wild-type ouder allelen 13.
- Genomic DNA (3 pg) wordt gewonnen uit de homozygoot mutant Columbia (M3) met een Qiagen DNeasy Plant Mini Kit en is ingediend voor Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sequencing.
- De homozygoot mutant Columbia (M3) wordt gekruist met Landsberg erecta om een mapping populatie te genereren.
- De afbeelding wordt uitgevoerd op 70 tot 100 F2 individuen die de afwijkende fenotype en hetzelfde aantal F2 planten met een wild-type fenotype.
- Verzamel van elke plant een blad-schijf (0,60 mm) met behulp van een perforator. Debladschijf worden verzameld uit bladeren van dezelfde leeftijd om zeker te zijn om vergelijkbare hoeveelheden DNA te hebben. De monsters kunnen worden verwerkt voor genomische extractie afzonderlijk of in groepen. In dit geval is het mogelijk met 5-10 monsters zo verzamelen voor elk eppendorfbuisje dat uiteindelijk u minder eppendorfbuisjes waarvan genomisch DNA worden ontleend.
- MasterPure Plant blad DNA zuiveringssamenstel (Epicentre) wordt gebruikt om de genomische DNA extraheren. De genomische DNA dat is verkregen van elk monster wordt gekwantificeerd met een nanodrop.
- Dezelfde hoeveelheid van genomisch DNA van elk monster wordt samengesteld tot een totaal van 300 ng (~ 30 pi) van plantaardige DNA, wordt 60 pi 2,5 x random primers oplossing [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-mercaptoethanol, 750 pg / ml oligodeoxyribonucleotide primers (random octamers)] (Bioprime kit) en 42 pi water (eindvolume 132 ul).
- Denatureren DNAs bij> 95 ° C gedurende 5 tot 10 minuten.
- Cool op ijs.
- Om elk denaturood DNA voeg 15 pi 10X dNTPs mix met biotine dCTP [1 mM biotine-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), en compleet met 3 pl Klenow polymerase (Bioprime kit).
- Incubeer nacht bij 25 ° C.
- De volgende dag, voeg 15 uL 3 M NaOAc en 400 ul koude 100% EtOH; mix.
- Incubeer bij -80 ° C gedurende 1 uur, vervolgens centrifugeren bij 20.500 xg gedurende 15 minuten verwijderd supernatant en wassen met 500 ul koud 75% EtOH.
- Spin op 20.500 xg gedurende 10 minuten.
- Droog DNA pellets bij 37 ° C gedurende 10 min en hersuspenderen in 100 ul water.
- Gebruik 5 pi opbrengst en kwaliteitscontrole van een gel (figuur 2).
- Stuur 95 pl van etikettering reactie voor de wild-type en mutant voor GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array hybridisatie.
- De arrays worden gescand en de verkregen. CEL-bestanden worden geanalyseerd met behulp van R-software ( http://www.r-project.oRG /).
- Installeer R software, open dan het programma en plak de volgende tekenreeks:
bron (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
Druk dan op enter-dit installeert de standaard Bioconductor pakketten ( http://www.bioconductor.org ). - In een nieuwe map op uw bureaublad te downloaden vanaf de volgende website ( http://www.naturalvariation.org/methods ) de bestanden:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
Het bestand ColLerCEL.zip moet worden uitgepakt en de resulterende bestanden plakken in uw nieuwe map. - Wijzig de naam van de gegevens die u van uw GeneChip experiment in wildtype.CEL en mutant.CEL.
- Kopieer nu uw GeneChip gegevens (wildtype.CEL enmutant.CEL) in uw map.
- Open R, a) voor de Mac: klik op "Misc" en klik vervolgens op "Change working directory." b) voor de PC: klik op "File" en vervolgens "Change directory"
- a) voor de Mac: Selecteer de map met de bestanden. Klik op "Werkruimte", "Load werkruimte bestand" en selecteer ath1V5.RData, b) voor de PC: Selecteer de map met de bestanden hierboven, klikt u op "Bestand", dan "Load werkruimte" en selecteer ath1V5.RData.
- Open readCEL.R met Kladblok en kopieer de hele tekst aan R.
- Open SFP.R met Kladblok en kopieer de hele tekst aan R.
- Open Map.R met Kladblok en kopieer de hele tekst aan R.
- In de console venster ziet u het volgende bericht:
X-chromosoom beperkt Mb yz
Zoek genen op TAir plak in deze link
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& End = z - Kopieer en plak de link in uw internet browser. Er verschijnt een venster en vraag te openen of sla het bestand op, je moet selecteren op te slaan. Kies een bestandsnaam en de extensie kunnen hechten ". Xls", klik op Opslaan.
- Open het bestand ". Xls" waar u de coördinaten van uw mutant (het resultaat wordt grafisch weergegeven in Figuur 3) te vinden.
- Binnen de in kaart gebrachte gebied in de verzamelde Illumina leest van de mutant genoom te identificeren specifieke EMS overgangen 4 onder de single nucleotide polymorfismen. Aanvulling op de mutant fenotype door transformatie met wild type gen (en) volgens standaardprocedures 15.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont de benadering voor de identificatie van een mutant van de secretieroute via confocale microscopie screening. Figuur 2 een typische bereiding van gelabelde genomische DNA voor array hybridisatie. In figuur 3 is een typisch resultaat verwacht na het analyseren van de gegevens van de GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array wordt gepresenteerd.
Figuur 1. Arabidopsis transgene planten die ssGFPHDEL (ER marker) (1) werden gekweekt om voldoende zaden voor EMS behandeling (2) te produceren. Zaden die werden behandeld met EMS werden vervolgens uitgezaaid naar M1 planten (3) te genereren. Elke M1 fabriek staat voor een andere lijn en het zaad afzonderlijk wordt ingezameld bij elk van hen. M2 zaad werden geplaat op ½ MS substraat (4) en vervolgens gescreend op gebreken ER morfologie van confocale microscopie (5). Tijdens de screening bleek planten behouden de wild-type ER morfologie (6) en planten defecte ER fenotypen (7) vertonen. Deze planten gekweekt de M3 generatie te verkrijgen en het fenotype (8) te bevestigen. Genomisch DNA uit M3 planten werd gebruikt voor Solexa Illumina sequencing (a). Dezelfde plantwerd ook gebruikt voor kruisingen met Ler-wt de F2 in kaart brengen van de bevolking (b) te verkrijgen.
Figuur 2. Bioprime willekeurige labelingsreacties (5 pi van 100 pl) werden op een agarose gel%. Lane is een uit een pool van wild-type F2 planten en laan b komt uit een pool van mutant F2 planten. (Marker is 1 Kb DNA-ladder-N3232, van NEB).
Figuur 3. De afbeelding is een voorbeeld van het in kaart brengen van de Col-0 mutatie met behulp van GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array hybridisatie. De mutatie in dit voorbeeld bevindt zich op chromosoom 1, begrensd door verticale balken. De horizontale balken geven de drempels voor detectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven een confocale microscopie-screening voor de identificatie van endomembraan mutanten. Deze benadering kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere organellen van de cel die specifieke fluorescente eiwit markers zijn. Het scherm is gebaseerd op de identificatie van mutanten die een afwijkende verdeling van de fluorescerende merker hetzij het doel organel of organellen die niet bedoeld om de marker bevatten vertonen. Respectievelijk deze mutanten vertegenwoordigen populaties die hetzij het vermogen van de organel de marker subcompartimentalize gecompromitteerd of mutanten die zich niet op de marker transloceren onder organellen. Tijdens de screening we dat enkele mutanten een fenotype heeft in eerste ontwikkelingsstadium reeds na 7 dagen kieming, maar andere bleek het fenotype pas in een later stadium van ontwikkeling. Dit kan weliswaar worden gekoppeld aan een aantal redenen, zoals de ontwikkeling afhankelijk expressie van het gemuteerdeallel (en), duidt dit erop dat planten worden onderzocht op verschillende groeistadia (ten minste 7 tot 14 dagen) om te waarborgen dat potentieel interessante mutanten niet worden verwijderd.
De aanpak beschreven in dit protocol laat ons toe om een gen in kaart te brengen in een relatief korte tijd in vergelijking met de klassieke methode in kaart brengen. In feite verzamelen van een voldoende aantal individuen van de populatie F2 voor de GeneChip Array vereist een relatief kleine hoeveelheid in vergelijking met F2 planten vereist voor de klassieke fijne mapping procedure. Er zijn kritische stappen die genomen moeten worden. Selectie van F2 populatie monsters met of met de fenotype moet zorgvuldig worden uitgevoerd, aangezien de toevoeging van nog een klein aantal planten verkeerde fenotype per ongeluk kunnen fouten introduceren in het uiteindelijke resultaat. Dit is vooral verband met het feit dat de populatie F2 voor de ruwe mapping zeer klein is. Daarom is de selectie van planten die EIThaar te laten zien of niet zien het fenotype moet elke keer worden gehouden op dezelfde dag na kieming. Dit is omdat, zoals boven vermeld, het uiterlijk van het fenotype kan worden gekoppeld aan groei. Een ander belangrijk punt van overweging is om zorgvuldig te kijken naar de volgende generatie data postalignment, die wordt gegenereerd door programma's die ons belangrijke informatie, zoals het percentage van de leest met de variant. De theoretische waarde verwacht een heterozygote variant ongeveer 50% betekent dat 50% van de sequenties zou bevatten variant terwijl een homozygote variant is circa 100%. Helaas situatie na postalignment kan ver van de theoretische waarde, namelijk het percentage leest met de variant van heterozygote kan variëren van 20 tot 80% terwijl van 60 tot 100% van homozygote 16. Derhalve niet om missen belangrijke een aantal polymorfismen (SNP), is het belangrijk om geen mutanten ontdoen met minder dan 100% Percentage van readvertenties voor de variant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen steun van de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (award aantal DE-FG02-91ER20021) en de National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wij zijn dankbaar voor mevrouw Karen Vogel voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
