Summary
Мы разработали новый протокол для повышения эффективности экстракорпорального дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Дифференцированных клеток ES приобретенные моторные нейроны есть о чем свидетельствует выражение нейронов и двигательных нейронов маркеров использованием иммуногистохимических методов.
Abstract
Прямая дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в функциональных двигательных нейронов представляет собой перспективный ресурс для изучения механизмов болезни, для отбора новых соединений, лекарственных средств и разработать новые методы лечения для моторных нейронов заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия (СМА) и бокового амиотрофического склероза ( ALS). Многие современные протоколы используют комбинацию ретиноевая кислота (RA) и звуковой еж (Тсс), чтобы отличить мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в моторные нейроны 1-4. Тем не менее, дифференциация эффективности ЭСК в моторные нейроны только встретился с умеренным успехом. Мы разработали два шага дифференциации протокол 5, что значительно повышает эффективность дифференциации в настоящее время по сравнению с установленными процедурами. Первый шаг заключается в повышении neuralization процесс, добавив Noggin и фибробластов ростовыми факторами (FGFs). Noggin представляет собой белок, костные морфогенетические (BMP) антагонист и участвует в нервной индукцииccording по умолчанию модель нейрогенеза и приводит к образованию передних нейронные паттерны 6. FGF сигнализации действует синергически с Noggin в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронной идентичности 7-9. На этом этапе ЭСК клетки загрунтовать Noggin, bFGF и FGF-8 в течение двух дней, чтобы способствовать дифференциации на нейронных линий. На втором этапе, чтобы побудить двигательных нейронов спецификации. Noggin / FGFs подвергаются ЭСК клетки инкубировали с РА и Shh агонист, сглаженным агонистов (SAG), в течение еще 5 дней для облегчения двигательных нейронов поколения. Для контроля за дифференциацию беспорядок в моторные нейроны, мы использовали линию ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9 1. Используя этот надежный протокол, мы достигли 51 ± 0,8% дифференциация эффективности (п = 3, р <0,01, Стьюдента-тест) 5. Результаты иммунофлуоресцентногоокрашивание показало, что GFP + клеток выразить двигательных нейронов специфических маркеров, остров-1 и холинацетилтрансферазы (чат). Наш двухступенчатый дифференциации протокол обеспечивает эффективный способ дифференцировать ЭСК клетки в спинном моторных нейронов.
Protocol
1. Шаг 1: мышь эмбриональных стволовых (ЭСК) культуры клеток (сроки: 3 дня)
1. Нанесение первичного эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ)
- Пальто четыре 100-мм культуры тканей блюда с желатином для адгезии ПМЭФ. Добавить 8 мл 0,1% раствора желатина (StemCell технологий) для каждого блюда и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалите излишки желатина из блюд. Не ополаскивать посуду.
- Развести один флакон Митомицин С инактивированной ПМЭФ (Millipore), который содержит ок. 5 х 10 6 клеток в 40 мл ПМЭФ средства массовой информации (см. рецепт в Таблице 1) и пластины на четыре 100-мм блюда культуре ткани. ПМЭФ обеспечить фидерного слоя для ЭСК.
- ПМЭФ должны быть покрыты по крайней мере один день, прежде чем добавлять культуры ЭСК клетки. ПМЭФ может быть использовано до 1 недели после покрытия.
2. Покрытие ЭСК клетки
Для контроля эффективности клеточной дифференцировки ЭСК в моторные нейроны, Мы использовали HBG3, линия ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9.
- Размораживание 1 флакон HBG3 ЭСК (примерно 1 х 10 7, способствовал д-р Дуглас Керр, Johns Hopkins University) в 37 ° С на водяной бане. Добавить 5 мл ES СМИ (см. рецепт в таблице 1) в 15 мл трубку и спином вниз клеток на 800 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ЭСК клетки ресуспендируют в 20 мл среды ES с недавно добавила Лейкемия тормозной фактор (LIF) в конечной концентрации 10 нг / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: LIF должна быть добавлена в день использования и обязаны поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние.
- Удалить 10 мл ПМЭФ средств массовой информации в ПМЭФ в каждом блюде и добавьте 10 мл клеточной суспензии HBG3 ES в каждом блюде.
- 24 ч после покрытия, МЧС клетки образуют небольшие колонии, похожие по размеру колонии указано стрелкой на рисунке 1b. 72 ч после покрытия, колоныэс увеличиваются в размерах, многие из которых около 100 мкм в диаметре (рис. 1В, показаны стрелками). Эти клетки готовы к дифференциации. СМИ должны быть заменены ежедневно для поддержания пролиферации клеток.
2. Шаг 2: Нейронные индукционные (Время проведения: 2 дня)
Чтобы стимулировать дифференцировку клеток ЭСК в моторные нейроны, ЭСК клетки должны быть отделены от ПМЭФ и культивировали в суспензии окружающей среды. Желатин покрытием колбы, используемый для разделения ПМЭФ из ЭСК.
- Когда колонии ЭСК готовы к индукции нервной (определяемых как дифференциация день 0), 2 слой T150 колбы с 0,1% желатина (18 мл / колбы) в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем удалить излишки желатин и промыть 1x PBS в три раза. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый 100-мм блюдо культуры понадобится один-T150 желатин покрытием колбы отделить ПМЭФ.
- Осторожно снимите СМИ стремление, следя, чтобы не выбить свободно прилагается колонии. Добавить 10 мл PBS краткиеют, а затем удалить стремлением завершить мыть шаг.
- Чтобы отделить ЭСК клетки ПМЭФ, добавить 0,25% трипсин / ЭДТА (3 мл / блюдо, StemCell технологий) и инкубировать в течение 3-5 мин при температуре 37 ° C до стволовых клеток и ПМЭФ оторваться от плиты. Добавить 15 мл свежей среды ES без LIF и пипетки клетки вверх и вниз, чтобы сломать колоний (15-20 раз). Затем добавить 0,1% желатином покрытием колбы T150 и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C. После инкубации ПМЭФ должны приложить к поверхности, а желатинизированный ЭС клетки должны быть плавающим. Собери плавающих ЭСК в 50 мл трубку.
- Спином вниз со скоростью 800 оборотов в минуту и ресуспендирования клеток в 10 мл нейронных среднего дифференциации (см. рецепт в таблице 1).
- Подсчитайте клеток с использованием гемоцитометра а затем пластина примерно 2 х 10 6 MES клеток на 100-мм бактериальной или суспензионной культуре блюдо. Эти плиты позволяют роста суспензионных культур и способствовать формированию эмбриоидные тела (ЭТ).
- На дифференциацииТион день 1 ЭСК клетки образуют небольшие плавающие агрегаты (EBS), которые видны под световым микроскопом. Любой перенос ПМЭФ придают блюду. Передача суспензии клеток и средств массовой информации в 15 мл и трубы центрифуги на низкой скорости (500 оборотов в минуту) в течение 3 мин. Аспирируйте СМИ тщательно, добавить 10 мл свежего нейронных среднего Дифференциация в гранулированной EBS, а затем пластина клеток в новые бактериальные блюдо. В дополнение к пополнению средств массовой информации, этот шаг снимает любую ПМЭФ, что перенести из предыдущего шага.
- О разграничении день 2, ЭТ готовы быть вызван в моторные нейроны.
3. Шаг 3: Спецификация двигательных нейронов (сроки: 5 дней)
- О разграничении 2-й день, вихревые культуры блюдо и передачи информации и ЭТ в 15 мл трубку. Пусть ЭТ поселиться под действием силы тяжести (~ 10 мин) или путем центрифугирования на низкой скорости (500 оборотов в минуту) в течение 3 мин.
- Аспирируйте среднего тщательно и ресуспендируют ЭТ в 10 мл дифференциации двигательных нейронов (БДН) среды (см. рецепт в
- О разграничении день 7 ЭТ должна быть примерно 150 - 200 мкм в диаметре и должна выражать сильные сигналы GFP (рис. 1в). Эти ЭТ готовы быть отделена и покрытием на poly-DL-ornithine/laminin покрытие посуды и покровные.
4. Шаг 4: Подготовка Poly-DL-ornithine/laminin покрытием Покровные (Время проведения: 2 дня)
За два дня до диссоциации ЭТ (т.е. дифференциация 5-й день), готовить poly-DL-ornithine/laminin-coated покровные.
- Место 12-мм выстрел покровные (Warner Instruments) в нижней части 24-луночного планшета. Растворите 25 мг поли-DL-орнитин (Sigma-Aldrich) в 25 мл стерильной дважды дистиллированной воде (D 2 H 2 O), чтобы получить 10X маточного раствора (1 мг / мл). Когда все будет готово для использования, чтобы 1/10 разведения поли-DL-орнитин с D 2 H 2 O для получения концентрациямирацион 100 мкг / мл. Добавить 0,5 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируют при температуре 4 ° С ночью.
- На следующий день (дифференциация 6-й день), аспирации поли-DL-орнитин и пусть плиты и крышки скользит сухой воздух в капюшоне культуре ткани. Промыть пластины скважин с D 2 H 2 O в три раза. Пусть воздух сухой еще час.
- Растворите 1 мг мыши ламинин (Millipore) в 5 мл ледяной холодной 1X PBS, чтобы 100x маточного раствора (200 мкг / мл). Когда все будет готово для использования, чтобы 1/100 разведения в ледяной холодной 1X PBS (2 мкг ламинин / мл). Добавить 0,5 мл / лунку в 24-луночного планшета и инкубировать в температуре 4 ° С ночью. Перед посевом клеток, избыток ламинин должны быть удалены и колодцев промыты 1X PBS в два раза. Покровные стекла могут быть сохранены в МНД среды (0,5 мл / лунку).
5. Шаг 5: Axon удлинение (Время проведения: 2 дня)
- О разграничении 7 дней, собрать ЭТ в 15 мл трубки и позволяют решить ЭТ (около 3 мин). Аспирата СМИ и повторно сuspend ЭТ в PBS. Позвольте ЭТ отстояться и потом вдохнуть PBS. Повторите этот шаг в 3 раза. Добавить 1 мл Accumax (Millipore) в ЭТ, осторожно перемешать и выдержать в течение 5 мин при комнатной температуре. После аспирации избыточного Accumax покрытие EBS.
- Чтобы отделить EBS, добавить 3 мл среды МНД. Внесите вверх и вниз 20 раз, с использованием 1 мл Eppendorf микропипетки (синий кончик), чтобы сорвать EBS. Выдержите в течение 2 мин при комнатной температуре. Передача клеточной суспензии для 12x75 мм труба с крышкой ячейки фильтра (BD Falcon) для получения суспензии отдельных клеток. Повторите этот шаг диссоциации с остальными и сгустки клеток сохраняется фильтр таким образом, чтобы обогатить выход отдельных клеток. Окончательный суспензии отдельных клеток будет 6 мл.
- Аккуратно перемешайте этой суспензии отдельных клеток и подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Развести клеток в МНД среды (с добавлением 10 нг / мл каждого BDNF, GDNF, CNTF и NT-3) плотностью 2x10 5 клеток на миллилитр. Добавить клеточной суспензии (0,5 мл / лунку) в 24-луночных содержащие Роly-DL-ornithine/laminin покрытием покровные (ранее полученного, как описано выше). Дифференцированных клеток продлить долго невриты через 2 дня в области культуры (рис. 1D).
6. Представитель Результаты
Рисунок 1А показывает схему протокола. На шаге 1, ЭСК клетки культивируют на ПМЭФ и дополнены LIF для предотвращения спонтанной дифференцировки. В общем, недифференцированные ЭСК колонии круглые и компактные, и четко определены края. Колонии не находятся в контакте друг с другом. Как правило, ЭСК клетки должны быть разделены в соотношении 1:4 каждые 2 ~ 3 дня. Тем не менее, каждая клеточная линия будет расти с разной скоростью и коэффициенту распределения должен быть определен эмпирически. Стрелки на рисунке 1b показывают типичное появление ЭСК после культивирования на слой ПМЭФ подачи в течение 3 дней. Эти колонии крупные (50-100 мкм в диаметре), но по-прежнему поддерживать круглые и определены краяс. На этом этапе колонии готовы к дифференциации или субкультуры. Стрелка на рисунке 1b показывает небольшую колонию ЭСК, которые обычно находят через 24 ч после покрытия. Через четыре дня после покрытия, ЭСК клетки обрастают. Они показывают, плоский вид и потеря определенных границах, о том, что они начинают дифференцироваться. Такие клетки не являются оптимальными для дифференцировки в нервные клетки.
Чтобы дифференцировать ЭСК клетки в моторные нейроны, клетки ЭСК необходимо культивировать в суспензии, условия, позволяющие EB образования. В шаге 2, ЭС клетки переносятся на культуру поверхность без фидерного слоя содействовать EB образования. На этом этапе они инкубируют в нейронных среднего Дифференциация дополнить Noggin, bFGF и FGF-8 в течение 2 дней в прямом клеток нейронной линии. Малый ЭТ можно наблюдать под микроскопом на 1-й день дифференциации. Они должны быть плавающие в среду. Перенос ПМЭФ также можно найти на 1-й деньдифференциации и должны быть удалены. Эти клетки придерживаются бактериальных блюда так устраняются при ЭТ являются пассировать на новый бактериальный блюдо. Таким образом, 2-й день дифференциации, мало или совсем нет ПМЭФ следует рассматривать в культуре блюдо. На шаге 3, продолжение передачи ЭТ новые блюда должны обеспечить устранение любых оставшихся ПМЭФ. ЭТ культивировали в дифференциации двигательных нейронов (БДН) среде с РА и НКГ в течение 5 дней, чтобы дифференцировать клетки в моторные нейроны. В культуре, ЭТ продолжают расти в размерах и можно увидеть невооруженным глазом в дифференциации день 3 ~ 4. Рисунок 1С показывает микроскопических появление ЭТ на дифференциацию 7-й день. В отличие от недифференцированных клеток, EBS показывают сильную флуоресценцию в связи с выражением GFP. Эти ЭТ оптимально дифференцированной и готовы к диссоциации. Проточная цитометрия показала, что 51% ± 0,8% клеток из диссоциированных ЭТ были дифференцированы в GFP экспрессирующие клетки 5. В пункте 5, культура йесе моторных нейронов в присутствии GDNF, CNTF, BDNF и NT3 результатов в расширении долго аксонального прогнозы. Рисунок 1D показывает появление дифференцированных клеток через 2 дня после покрытия диссоциированных EBS. Обратите внимание, долго невриты простирается от клеточных тел покрытием клеток. Иммунофлуоресцентного окрашивания показывает, что GFP + клеток выразить пан-нейронов маркер (нейрофиламентов среднего цепи) и двух двигательных нейронов специфических маркеров (остров-1 и холинацетилтрансферазы, рисунок 2).
Рисунок 1. Дифференциация ЭСК в моторные нейроны (картинка изменилась с Wu и соавт. 5). А) схема дифференциации протокол от ЭСК клетки моторных нейронов. B) Недифференцированная ЭСК из круглых колоний в верхней части слоя подачи фибробластов. Они имеют слабое выражение GFP. C) ЭСК клетки были отделены от подачи слоев и cultuкрасный с низким уровнем вложений блюд для формирования ЭТ. В течение первых двух дней процесса дифференцировки, клетки подвергали воздействию 50 нг / мл Noggin, 20 нг / мл bFGF и 20 нг / мл FGF-8. Впоследствии они были вынуждены дифференцировать с 1 мкМ ретиноевой кислоты и 1 мкМ звуковой еж агонист SAG в течение 5 дней. Дифференцированных ЭСК решительно флуоресценции GFP. D) После 7-дневного дифференциации ЭТ были диссоциированы и покрытием на poly-DL-ornithine/laminin покрытие пластин. Дифференцированных клеток продолжительного нервных процессов, через 2 дня в области культуры. Шкала бар = 200 мкм. MN = двигательных нейронов. B, C и D являются яркие образы поля и B, C и D являются соответствующие флуоресцентные изображения.
Рисунок 2. Характеристика ЭСК клеточных производных моторных нейронов. Иммунофлуоресценции для окрашивания нейрофиламентов средней цепью (NF-M, красный), ЧАТ (красный), и остров-1 (красный) был совпадают с GFP (зеленый) выражениеession. DAPI (синий) был использован для идентификации ядер. Шкала бар = 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки делятся каждые 12-15 ч, культуральной среде истощаются быстрее и должны быть заменены в день.
Эффективное активации Тсс путь является критическим параметром, необходимые для индуцирования двигательных нейронов спецификации. Тсс белка (R & D System), и Тсс сигнализации агонисты, такие как Hh агонист HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem) и SAG (EMD Chemicals) все были использованы для содействия формированию моторных нейронов 1-3 , 10,11. Мы обнаружили, НКГ, чтобы быть более эффективным, чем молекулы purmorphamine в дифференциации клеток на двигатель нейронов фенотип 5. 1 - 2,5 мкм purmorphamine с 1 мкМ РА никогда не давал дифференциации эффективность более чем на 20%. Однаков наших руках комбинация 1 мкМ РА и 1 мкМ SAG дал дифференциации эффективность примерно на 25% в процедурах без нейронной индукции.
Для дальнейшего повышения эффективности дифференциации, мы добавляем 2-дневный нервный индукции до спецификации шаг двигательных нейронов. Такой подход имеет преимущество в том, что оба Noggin и FGF сигнализации имеют решающее значение для ранней стадии индукции нервной, когда эмбриональные клетки сначала ввести нервные линии 6-9. В дополнение к индукции нервной, FGF сигнализации поддерживает культуру как нейронные клетки-предшественники. Избыточная Fgf8 в развивающемся мозге приводит к резкому расширению нейронные популяции предшественников в желудочковой зоны 12. Сочетание FGFs и Noggin действует синергически в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронных личности 9. Таким образом, 2-дневный нейронной индукции предназначена направить ЭСК клетки кнейронных линии до начала процесса спецификации моторных нейронов.
Протокол, описанный здесь, представляет собой модификацию и расширение оригинального создан протокол, описанный ранее 1. Хотя сроки получения моторных нейронов то же самое, мы сделали ряд изменений для упрощения процедуры и повышения выхода моторных нейронов. При добавлении нейронной индукции к дифференциации протокол, мы можем увеличить дифференциацию эффективности от 25% до 50%. Наш протокол обеспечивает эффективный подход к обогащению моторные нейроны, полученные из ЭСК. Моторные нейроны не могут быть получены из SMA пациентов и плохое состояние здоровья первичных двигательных нейронов от мышей SMA исключает выделение клеток достаточное количество, качество и чистота выполнения количественного анализа белков затронуты этим заболеванием. Используя этот протокол ЭСК клетки, мы смогли получить клетки двигательных нейронов населения достаточно квантовойTity и чистоты для протеомных исследований для определения молекулярных путей, пострадавших в спинальной мышечной атрофией 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта рукопись, посвященная памяти доктора Wenlan Ван, который скончался 26 мая 2011 года. Мы благодарим д-р Douglas A. Kerr для обеспечения щедро HBG3 ЭСК клетки, используемые в этом исследовании. Эта работа финансировалась Немур, Грант (2 RR016472-10) под INBRE программы Национального центра по исследованию ресурсов (NCRR), а награду Кобре грант NCRR (5 P20 RR020173-05) для поддержки центра Детская исследований Альфреда И. Дюпон больницы для детей, Уилмингтон, штат Делавэр, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
