Мы разработали новый протокол для повышения эффективности экстракорпорального дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Дифференцированных клеток ES приобретенные моторные нейроны есть о чем свидетельствует выражение нейронов и двигательных нейронов маркеров использованием иммуногистохимических методов.
Прямая дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в функциональных двигательных нейронов представляет собой перспективный ресурс для изучения механизмов болезни, для отбора новых соединений, лекарственных средств и разработать новые методы лечения для моторных нейронов заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия (СМА) и бокового амиотрофического склероза ( ALS). Многие современные протоколы используют комбинацию ретиноевая кислота (RA) и звуковой еж (Тсс), чтобы отличить мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в моторные нейроны 1-4. Тем не менее, дифференциация эффективности ЭСК в моторные нейроны только встретился с умеренным успехом. Мы разработали два шага дифференциации протокол 5, что значительно повышает эффективность дифференциации в настоящее время по сравнению с установленными процедурами. Первый шаг заключается в повышении neuralization процесс, добавив Noggin и фибробластов ростовыми факторами (FGFs). Noggin представляет собой белок, костные морфогенетические (BMP) антагонист и участвует в нервной индукцииccording по умолчанию модель нейрогенеза и приводит к образованию передних нейронные паттерны 6. FGF сигнализации действует синергически с Noggin в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронной идентичности 7-9. На этом этапе ЭСК клетки загрунтовать Noggin, bFGF и FGF-8 в течение двух дней, чтобы способствовать дифференциации на нейронных линий. На втором этапе, чтобы побудить двигательных нейронов спецификации. Noggin / FGFs подвергаются ЭСК клетки инкубировали с РА и Shh агонист, сглаженным агонистов (SAG), в течение еще 5 дней для облегчения двигательных нейронов поколения. Для контроля за дифференциацию беспорядок в моторные нейроны, мы использовали линию ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9 1. Используя этот надежный протокол, мы достигли 51 ± 0,8% дифференциация эффективности (п = 3, р <0,01, Стьюдента-тест) 5. Результаты иммунофлуоресцентногоокрашивание показало, что GFP + клеток выразить двигательных нейронов специфических маркеров, остров-1 и холинацетилтрансферазы (чат). Наш двухступенчатый дифференциации протокол обеспечивает эффективный способ дифференцировать ЭСК клетки в спинном моторных нейронов.
Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта рукопись, посвященная памяти доктора Wenlan Ван, который скончался 26 мая 2011 года. Мы благодарим д-р Douglas A. Kerr для обеспечения щедро HBG3 ЭСК клетки, используемые в этом исследовании. Эта работа финансировалась Немур, Грант (2 RR016472-10) под INBRE программы Национального центра по исследованию ресурсов (NCRR), а награду Кобре грант NCRR (5 P20 RR020173-05) для поддержки центра Детская исследований Альфреда И. Дюпон больницы для детей, Уилмингтон, штат Делавэр, США.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
PMEF medium | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
mES medium | |||
DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
Neural Differentiation medium | |||
DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
MND medium (differentiation) | |||
ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
MND medium (Motor Neuron culture) | |||
ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.