Summary
Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.
Abstract
Fonksiyonel motor nöronların embriyonik kök (ES) hücreleri doğrudan farklılaşma, hastalık mekanizmaları incelemek için yeni ilaç bileşikleri taranması ve bu spinal müsküler atrofi (SMA) ve Amyotrofik lateral skleroz (gibi motor nöron hastalıkları için yeni tedaviler geliştirmek için bir umut kaynağı temsil ALS). Birçok mevcut protokoller motor nöronların 1-4 içine fare embriyonik kök (MES) hücreleri ayırt etmek için retinoik asit (RA) ve sonik kirpi (Sus) bir arada kullanabilirsiniz. Ancak, motor nöronların içine MES hücrelerin farklılaşması verimliliği sadece ılımlı bir başarı ile bir araya geldi. Şu anda önemli ölçüde standart prosedürlere göre farklılaşma etkinliğini arttırır iki adımlı bir farklılaşma protokolü 5 gelişmiştir. Birinci adımda Noggin ve fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ekleyerek neuralization işlemi arttırmaktır. Noggin bir kemik morfogenetik protein (BMP) antagonistidir ve nöral indüksiyon karışmış birnöron ve ön sinirsel desenlendirme 6 oluşumunda sonuçların varsayılan modeline ccording. FGF sinyal posterior nöral kimlik 7-9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep olarak Noggin ile sinerjik olarak hareket eder. Bu adımda, MES hücre soyları sinirsel doğru farklılaşmasını teşvik etmek için, iki gün süre ile Noggin, bFGF ve FGF-8 ile astarlanmış edildi. İkinci aşamada, motor nöron özellikleri elde edilmesini sağlanmaktadır. Noggin / MES hücreleri maruz FGFs motor nöron üretimi kolaylaştırmak için başka bir 5 gün süreyle RA ve bir Shh agonisti, düzeltilir agonisti (SAG) ile inkübe edildi. Motor nöron içinde MESS farklılaşma izlemek için, motor nöron özel yükseltici HB9 1 kontrolü altında, bir transjenik farenin ifade EGFP türetilmiş bir ES hücre dizisi kullanılabilir. Bu sağlam protokolü kullanarak, ± farklılaşma verimliliği% 0.8 51 elde (n = 3, p <0.01, Student t-testi) 5. Immünofloresan elde edilen sonuçlar,boyama GFP + hücrelerin motor nöron spesifik belirteçler, Islet-1 ve asetil kolin (ChAT) olduğunu göstermiştir. Bizim iki adım farklılaşma protokolü spinal motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için etkili bir yol sağlar.
Protocol
1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün)
1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF)
- PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın.
- Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive PMEF (Millipore) bir şişe sulandırınız. 5 x 10 6 PMEF ortam 40 ml içine hücreleri (Tablo 1 'de tarif bakınız) ve dört adet 100 mm'lik doku kültürü plakası üzerine tabaklar. PMEF MES hücreleri için bir besleyici tabakası oluşturmak.
- PMEF MES hücre kültürleri eklemeden önce en az bir gün kaplama edilmelidir. PMEF kaplama sonra 1 hafta kadar kullanılabilir.
2. Kaplama MES Hücreleri
Motor nöronların içine MES hücre farklılaşmasının etkinliğini izlemekBiz HBG3, motor nöron özel yükseltici HB9 kontrolü altında eksprese EGFP bir transjenik fare elde edilen bir ES hücre hattı kullanılır.
- Defrost 37 ° C su banyosunda HBG3 MES hücrelerin 1 flakon (yaklaşık 1 x 10 7, Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından katkı). 15 ml tüp ES medya (Tablo 1 tarife bakınız) 5 ml ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 rpm'de hücreleri aşağı spin.
- 10 ng / ml 'lik nihai bir konsantrasyon taze olarak eklendi Lösemi inhibe edici faktör (LİF) ile ES ortam 20 ml süpernatan aspirat ve Pastör pipetiyle MES hücreleri. NOT: LİF kullanım gününde ilave edilmesi ve farklılaşmadan durumda MES hücreleri korumak için gereklidir.
- Her yemekte PMEF 10 ml PMEF ortamı çıkarın ve her yemek için HBG3 ES hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin.
- 24 saat sonra kaplama, MES hücre boyutu Şekil 1B ok ile gösterilen koloni benzer küçük koloniler oluştururlar. Kaplama sonrası 72 saat, koloniboyutu es artış, çok sayıda çapı yaklaşık 100 mikron (Şekil 1B, oklarla gösterilen) olmak. Bu hücrelerin farklılaşması için hazırız. Ortam hücrelerinin proliferasyon korumak için günlük değiştirilmesi gerekir.
2. Adım 2: Sinir İndüksiyon (Zamanlama: 2 gün)
Motor nöron içinde MES hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek için, MES hücreleri PMEF ayrılmış ve bir süspansiyon bir ortamda yetiştirilir gerekir. Jelatin kaplı şişeler MES hücrelerinden PMEF ayırmak için kullanılır.
- MES koloniler nöral indüksiyon (farklılaşma gün 0 olarak tanımlanır), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin (18 ml / şişe) ile kat 2 T150 şişeler için hazır ve ardından aşırı jelatin kaldırmak ve 1x PBS üç kez yıkayın zaman. NOT: Her 100 mm çanak kültür PMEF ayırmak için bir T150-jelatin kaplı şişesi gerekir.
- Dikkatle gevşek bağlı koloniler çıkarmak için değil emin, aspirasyon ortamı çıkarın. 10 ml PBS kısa eklely ve sonra yıkama adımı tamamlamak için aspirasyon kaldırın.
- PMEF gelen MES hücreleri ayırmak için,% 0.25 eklemek tripsin / EDTA (3 ml / çanak, StemCell Teknolojileri) ve 37 'de 3-5 dakika inkübe ° C kök hücre ve PMEF levhadan ayırmak kadar. Koloniler (15-20 kez) kırmak için aşağı LIF ve pipet hücreleri olmadan 15 ml taze ES medya ekleyin ve. Daha sonra, bir% 0.1 jelatin kaplı T150 şişesine ilave ve 37 C'de 30 dakika inkübe ° C. ES hücrelerinin yüzen gerekirken inkübasyondan sonra, PMEF jelatinize yüzey eklemek gerekir. 50 ml'lik bir tüp içine kayar MES hücreler toplanır.
- (Tablo 1 tarife bakınız) Sinir Farklılaşma Orta 10 ml 800 rpm ve Pastör pipetiyle hücreleri aşağı Spin.
- Bir 100 mm bakteriyel ya da süspansiyon kültürü çanağı üzerine bir hemasitometre ve ardından plaka yaklaşık 2 x 10 6 MES hücreleri kullanılarak hücreleri hesaplama. Bu plakalar süspansiyon kültürleri büyüme izin ve embriyoid organları (EBS) oluşumunu arttırabilir.
- Differentia AçıkTION gün 1, MES hücrelerinin ışık mikroskobu altında görülebilen küçük kayan agrega (EBS) oluştururlar. Herhangi bir bulaşma, PMEF çanak eklemek. 3 dk için düşük hızda (500 rpm) 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve içine süspansiyon hücreleri ve medya transfer edin. Dikkatli medya aspire, yeni bir bakteriyel çanak plaka hücreleri daha sonra pelet EBS taze Sinir Farklılaşma Orta 10 ml ekleyin ve. Ortam ikmal ek olarak, bu adım adım önceden arta taşıyan herhangi bir PMEF kaldırır.
- Farklılaşma Gün 2, EBS motor nöronlar indüklenen hazırdır.
3. Adım 3: Motor Nöron Özelliği (Zamanlama: 5 gün)
- Farklılaşma gün 2, girdap kültürü çanak ve 15 ml tüp içine medya ve EBS aktarmak Açık. EBS ağırlık (~ 10 dakika) ile ya da 3 dk için düşük hızda (500 rpm) santrifüje edilerek dinlendiriniz.
- (Tarifi bkz. Motor Nöron Farklılaşma 10 ml (MSB) orta dikkatli ve Pastör pipetiyle EBS orta aspire
- Çapı 200 mikron ve kuvvetli GFP sinyali (Şekil 1C) ifade olmalıdır - farklılaşma 7. günde, EBS yaklaşık 150 olmalıdır. Bu EBS kaplı yemekleri veya lamelleri poly-DL-ornithine/laminin üzerine disosiye ve kaplama olmaya hazırız.
4. Adım 4: Poly-DL-ornithine/laminin Kaplı lameller hazırlanması (Zamanlama: 2 gün)
İki gün EBS dissociating önce (farklılaşma 5. gününde yani), poly-DL-ornithine/laminin-coated lamelleri hazırlamak.
- 24-iyi plakanın altına yerleştirin 12 mm yuvarlak lamelleri (Warner Araçlar). 10X bir stok çözelti (1 mg / ml) elde etmek için 25 mg 25 ml'de poli-DL-ornitin (Sigma-Aldrich), steril, çift damıtılmış su (d 2 H 2 O) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, konsantrasyonlarda elde etmek için d 2 H 2 O ile poli-DL-ornitin bir 1/10 dilüsyon yapmak100 mcg / ml oranı. Gece boyunca 4 at 24-kuyulu plakalı ve inkübe her bir yanı ° C ila 0.5 ml ilave edilir.
- Ertesi gün (farklılaşma günde 6), aspirat poli-DL-ornitin ve doku kültürü kaputu plakaları ve kuru kapak slipleri hava sağlar. D 2 H2O ile üç kez plakası kuyuları çalkalayın. Bir saat için hava kurumasını bekleyin.
- 100X stok solüsyonu (200 ug / ml) yapmak için buzlu soğuk PBS 1X 5 ml içinde 1 mg fare laminin (Millipore) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, buzlu-soğuk 1X PBS (2 mcg laminin / ml) 1/100 dilüsyon olun. 0.5 mL / 4 iyi bir 24-iyi plaka ve inkübe ° C gece için. Tohum hücreleri önce, aşırı laminin kaldırılır ve kuyular 1X PBS iki defa durulanmalıdır. Lamelleri MSB'nin ortamı (0.5 ml / oyuk) saklanabilir.
5.. Adım 5: Axon Uzama (Zamanlama: 2 gün)
- Farklılaşma Gün 7 günü, 15 ml tüp içine EBS toplamak ve EBS (yaklaşık 3 dakika) yerleşmesine izin. Aspirat ortam ve yeniden sPBS içinde uspend EBS. EBS yerleşmek ve sonra PBS aspire izin verin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, EBS üzere Accumax (Millipore) 1 ml ilave edilir. Sonra EBS kapsayan aşırı Accumax aspire.
- EBS ayırmak için, MSB orta 3 ml ekleyin. EBS bozmak için 1 ml Eppendorf mikropipet (mavi uç) kullanarak pipet aşağı yukarı 20 kez. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süzgecinden kap (BD Falcon) ile 12x75 mm tüp için hücre süspansiyonu aktarın. Tek hücrelerin verim zenginleştirmek şekilde filtre tarafından tutulan kalan topaklar ve hücreler ile ayrışma adımda tekrar edin. Nihai tek bir hücre süspansiyonu 6 ml olacaktır.
- Yavaşça bu tek hücre süspansiyonu karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2x10 ml başına 5 bir hücre yoğunluğuna MND ortamı (10, her BDNF ng / ml, GDNF, CNTF ve NT-3 ile desteklenmiş) içine hücreleri ile seyreltilir. Po içeren 24 kuyucuklu plaklar hücre süspansiyonu (0.5 ml / oyuk) ekleyinly-DL-ornithine/laminin kaplamalı lamelleri (yukarıda tarif edildiği gibi, daha önce hazırlanmış). Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün (Şekil 1D) sonra uzun neurites uzatmak.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1A protokolünün bir taslağını göstermektedir. 1. adımda, MES hücreleri PMEF üzerinde yetiştiriliyor ve spontan farklılaşmasını önlemek için LIF ile desteklenmiş. Genel olarak, farklılaşmamış MES koloniler yuvarlak ve kompakt olup, kenarları açıkça tanımlamıştır. Koloniler birbiri ile temas halinde değildir. Tipik olarak, MES hücrelerin her 2 ~ 3 gün 1:04 oranında bölünmüş olmalıdır. Ancak, her bir hücre hattı farklı bir oranda artacak ve split oranı ampirik olarak tespit edilmelidir. Şekil 1B oklar 3 gün için bir PMEF besleyici tabakaya kültürleme sonra MES hücrelerinin tipik görünüşünü göstermektedir. Bu koloniler büyük (çapı 50-100 mikron) ama yine yuvarlak ve tanımlanmış avantajı sağlamaks. Bu aşamada koloniler farklılaşma ya da alt kültür için hazırız. Şekil 1B bir ok ucu, genellikle kaplama 24 saat sonra bulduğu küçük bir MES koloni gösterir. Kaplama dört gün sonra, MES hücreleri büyümüş olur. Onlar ayrım başlıyor belirten düzleştirilmiş bir görünüm ve tanımlanan sınırlar kaybı gösterir. Böyle hücreler, nöronal hücre içine farklılaşma için optimal değildir.
Motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için, MES hücreleri EB oluşumuna izin süspansiyon koşullarda yetiştirilen gerekir. Adım 2'de, ES hücreleri EB oluşumunu teşvik etmek için bir besleyici tabakası olmadan bir kültür yüzey üzerine aktarılmaktadır. Bu adımda, bunlar bir sinir soyu için doğrudan hücrelere 2 gün süreyle Noggin, bFGF ve FGF-8 ile desteklenmiş Neural Farklılaştırma besiyerinde enkübe edilir. Küçük EBS farklılaşma 1. günde mikroskop altında görülebilir. Bunlar, orta yüzen edilmelidir. Bulaşma PMEF da gün 1 adresinde bulunabilirdiferansiyasyonun ve çıkarılması gerekir. Bu hücreler EBS yeni bir bakteriyel bir çanakla pasajlanmağa çok zaman ortadan kalkar bakteriyel yemekler uygun. Böylece, farklılaşma günde 2 tarafından, az ya da hiç PMEF kültürü tabağına görülmelidir. 3. adımda, yeni yemekler için EBS transferi kalan PMEF çıkarılmasını sağlamalıdır devam etti. EBS RA ile takviye Motor Nöron Farklılaşma (MSB) medya kültürü ve motor nöronların içine hücreleri ayırt etmek için 5 gün boyunca SAG edilir. Kültür sırasında, EBS boyutları büyümeye devam ediyor ve farklılaşma 3. günde çıplak gözle görülebilir ~ 4. Şekil 1C farklılaşma 7. günde EBS mikroskobik görünüm gösterir. Farklılaşmamış hücrelerin aksine, EBS GFP ekspresyonu nedeniyle güçlü floresans gösterir. Bu EBS optimal farklılaşmış ve ayrışma için hazırız. Akış sitometrisi% 51 ± ayrışmış EBS gelen hücreler% 0.8 'i ifade eden hücrelerin 5 GFP ayrışmıştır olduğunu gösterdi. Adım 5, inci kültürdeGDNF, CNTF, BDNF, ve uzun akson uzantısı projeksiyonlar NT3 sonuçlar varlığında ese motor nöron. Şekil 1B 2 gün ayrışmış EBS'nin sonra kaplama farklılaşmış hücreler görünümünü gösterir. Kaplamalı hücrelerin hücre gövdeleri uzanan uzun neurites not edin. Immünofloresan boyama GFP + hücrelerin pan-nöronal marker (nörofilaman-orta zincirli) ve iki motor nöron spesifik belirteçler, (Islet-1 ve kolin asetiltransferaz, Şekil 2) ifade gösterir.
Şekil 1. Motor nöronları (resim Wu ve ark güncellenmiştir. 5) MES hücrelerin Farklılaşma. MES hücrelerinden motor nöron için farklılaşma protokolünün A) şeması. B) ayrım MES hücreler fibroblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluştururlar. Onlar zayıf GFP var. C) MES hücreleri besleyici ve katmanlar ayrıldı kültürlerdekiEBS oluşturmak için düşük eki yemekler kırmızı. Farklılaştırma prosesi ilk iki gün boyunca, hücreler 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml FGF-8 maruz bırakıldı. Daha sonra, onlar 1 uM retinoik asit ve 5 gün süreyle 1 uM sonik kirpi agonisti SAG ile ayırt etmek için oluşturuldu. Farklılaştırılmış MES hücreleri güçlü GFP floresan dile getirdi. D)-7 gün sonra farklılaşma, EBS poly-DL-ornithine/laminin kaplı levhalar üzerine ekildi ve ayrıştırıldı. Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün sonra uzun nöral süreçleri uzatıldı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. MN = motor nöron. B, C ve D parlak bir alan görüntüler ve B ', C' ve D 'ilgili floresans görüntülerdir.
Şekil 2,. MES hücresinden türetilmiş motor nöron karakterizasyonu. Nörofilaman orta zincirli (NF-M, kırmızı), ChAT (kırmızı) ve Islet-1 (kırmızı) immünofloresan boyaması GFP (yeşil) ifade tesadüf olduession. DAPI (mavi) çekirdekleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MES hücrelerinin kalitesi motor nöron verimli bir kuşak için en önemli bir parametredir. MES hücreler spontan farklılaşmasını önlemek için PMEF yetişen gerekir. LIF eklenmesi farklılaşmadan devlet MES hücrelerin korunmasına yardımcı olur. MES hücreler her 12-15 saat, bölme olarak kültür ortamı hızla tüketilmiş hale gelir ve günlük olarak değiştirilmesi gerekir.
Şşş yolunun Verimli aktivasyonu motor nöron özellikleri ikna etmek için gereken kritik bir parametredir. Şşş protein (Ar-Ge Sistemi) ve bu Hh agonist HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem) ve SAG (Merck) olarak Shh sinyalizasyon agonistleri tüm motor nöronların 1-3 oluşumunu teşvik etmek için kullanılmıştır , 10,11. Biz, bir motor nöron fenotipe 5 doğru hücreleri ayırmada purmorphamine göre daha etkili bir molekül olarak SAG bulundu. 1 - 1 uM RA ile 2.5 uM purmorphamine% 20'den fazla bir farklılaşma verimliliği vermedim. Ancakelimizde RA 1 uM'si ve SAG 1 uM'si bir arada bir nöral indüksiyon adım olmadan prosedürleri yaklaşık% 25 bir farklılaşma verimliliği verdi.
Daha ileri ayrıştırma verimliliğini artırmak için, önce motor nöron özellikleri adıma 2 günlük bir nöral indüksiyon adım ekleyin. Bu yaklaşım, embriyonik hücreler önce nöral lineage 6-9 girdiğinizde Noggin ve FGF sinyal hem de nöral indüksiyon erken evre için çok önemli olduğu gerçeği yararlanır. Sinir indüksiyon ek olarak, FGF sinyalleşme sinir prekürsör hücreleri gibi kültürleri korur. Gelişmekte olan beynin ortası Fgf8 aşırı ekspresyonu ventriküler zon 12 nöral prekürsör nüfusunun dramatik bir genişlemesine yol açar. FGFs ve Noggin kombinasyonu posterior nöral kimlik 9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep sinerjistik davranır. Böylece 2-günlük sinirsel indüksiyon adım doğru MES hücreleri yönlendirmek için tasarlanmıştırmotor nöron şartnamenin işlemi başlamadan önce, sinirsel soyu.
Burada tanımlanan protokol daha önce tarif 1 orijinal kurulan protokolünün bir değişikliği ile geliştirilmesidir. Motor nöronların üretme zaman çizelgesi aynı olsa da, biz prosedürü hızlandırmak ve motor nöronların verimi artırmak için bir dizi değişiklikler yaptık. Farklılaşma protokolü bir sinir indüksiyon adım ekleyerek, biz% 25 den% 50 farklılaşma verimliliği artırmak edebiliyoruz. Bizim protokol MES hücrelerden köken motor nöronlar zenginleştirmek için etkin bir yaklaşım sağlar. Motor nöronların SMA hastalarında elde edilen ve SMA fareleri birincil motor nöronların kötü sağlık yeterli miktar, kalite ve bu hastalıktan etkilenen proteinlerin kantitatif analizleri yapmak için saflık hücrelerin izolasyonu engeller edilemez. Bu MES hücre protokolü kullanarak, yeterli quan bir motor nöron hücre popülasyonu elde başardıkspinal müsküler atrofi 5 etkilenen moleküler yolları belirlemek için bir proteomik çalışma için tity ve saflık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu yazının May 26, 2011 tarihinde vefat Dr Wenlan Wang anısına adanmıştır. Biz cömertçe Bu çalışmada kullanılan HBG3 MES hücreler sağlamak için Dr Douglas A. Kerr teşekkür ederim. Bu çalışma Nemours tarafından finanse edildi, bir Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (NCRR) ve Merkezi desteklemek için NCRR bir Cobre hibe (5 P20 RR020173-05) INBRE program kapsamında hibe (2 RR016472-10) Çocuklar, Wilmington, Delaware, ABD için Alfred I. duPont Hastanesi Pediatrik Araştırma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
