Summary
我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。
Abstract
機能的な運動ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の直接分化は、病気のメカニズムを研究するための新しい薬剤化合物をスクリーニングするために、このような脊髄性筋萎縮症（SMA）および筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患の新しい治療法を開発するための有望なリソースを表します（ ALS）。現在の多くのプロトコルは、運動ニューロン1月4日に、マウス胚性幹（MES）の細胞を区別するために、レチノイン酸（RA）とソニックヘッジホッグ（Shh）の組み合わせを使用します。しかし、運動ニューロンへのMES細胞の分化効率は中程度の成功を収めている。我々は大幅に現在確立されているプロトコルと比べて分化効率を向上させる二段階の分化プロトコル5を開発しました。最初のステップは、ノギンと線維芽細胞増殖因子（FGFの）を追加することによって、神経誘導プロセスを強化することです。ノギンは骨形成タンパク質（BMP）のアンタゴニストであると神経誘導に関与している前方神経パターニング6の形成におけるニューロン新生と結果のデフォルトのモデルにccording。 FGFシグナリングは、後部神経アイデンティティ7-9を促進することにより、神経組織の形成を誘導するノギンと相乗的に作用する。このステップでは、MESの細胞は、神経系統に向かって分化を促進するために二日間ノギン、bFGFを、とFGF-8でプライミングされた。第二段階では、運動ニューロンの仕様を誘導することである。ノギン/ FGFの露出したMESの細胞が運動ニューロンの生成を容易にするために、別の5日間、RAとShhのアゴニスト、Smoothenedのアゴニスト（SAG）とインキュベートした。運動ニューロンへの混乱の分化をモニターするために、我々は運動ニューロン特異的プロモーターHb9 1の制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。この堅牢なプロトコルを使用して、我々は±分化効率の0.8％の51を達成した（n = 3、P <0.01、スチューデントの t検定）5。免疫からの結果染色は、GFP +細胞は運動ニューロン特異的マーカー、膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）を発現することを示した。私たちの二段階分化プロトコルは、脊髄運動ニューロンにMESの細胞を区別するための効率的な方法を提供します。
Protocol
1。ステップ1：マウス胚性幹（MES）細胞培養（タイミング：3日間）
1。めっきの主マウス胎児線維芽細胞（PMEF）
- PMEF接着のためにゼラチンでコート4 100 mmの組織培養皿。各ディッシュに0.1％ゼラチン溶液（StemCell Technologies）を8 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。
- 料理からゼラチンの過剰を削除します。お皿を洗わない。
- 約が含まれているマイトマイシンC不活化PMEF（ミリポア社製）1バイアルに希釈する。 5×10 6 PMEFメディアの40ミリリットルに細胞（ 表1のレシピを参照）および4 100 mmの組織培養皿上にプレート。 PMEFは、MES細胞のフィーダー層を提供しています。
- PMEFは、MESの細胞培養を追加する前に、少なくとも一日に播種する必要があります。 PMEFは、めっき後1週間まで使用することができます。
2。メッキMES細胞
運動ニューロンにMES細胞の分化の効率を監視するには、我々はHBG3、運動ニューロン特異的プロモーターの制御下Hb9 eGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。
- 霜37℃の水浴でHBG3 MES細胞の1バイアル（約1×10 7、博士ダグラスカー、ジョンズ·ホプキンス大学によって寄贈されました）。 15 mlのチューブにES培地（ 表1に示すレシピを参照してください）5 mlを加え、5分間800rpmで細胞をスピンダウンする。
- は10 ng / mlの最終濃度で新しく追加された白血病抑制因子（LIF）とESのメディアを20mlの上清を吸引し、再懸濁しMES細胞。注：LIFは、使用日に追加されるべきであり、未分化状態のMES細胞を維持する必要があります。
- 各皿にPMEFから10ミリリットルPMEFメディアを取り出して、それぞれの皿にHBG3 ES細胞懸濁液10mlを追加します。
- メッキ後24時間は、MESの細胞は、サイズが図1Bに矢印で示されたコロニーに似た小さなコロニーを形成しています。メッキ後72時間、コローニサイズのESの増加は、多くは直径が約100μm（ 図1B、矢印で示される）である。これらの細胞は、分化のための準備が整いました。メディアは、細胞の増殖を維持するために、毎日交換する必要があります。
2。ステップ2：神経誘導（タイミング：2日間）
運動ニューロンにMES細胞の分化を誘導するために、MES細胞はPMEFから分離し、懸濁液の環境で栽培する必要があります。ゼラチンコートしたフラスコをMES細胞からPMEFを区切るために使用されています。
- MESのコロニーは、神経誘導（分化0日として定義される）、室温で30分間0.1％ゼラチン（18ミリリットル/フラスコ）でコート2 T150フラスコの準備ができていると、余分なゼラチンを削除し、1X PBSで三回洗浄するとき。注：各100mmディッシュの文化はPMEFを分離する1つのT150-ゼラチンコートしたフラスコが必要になります。
- 慎重に緩く接続されたコロニーを取り除くために、ないことを確認し、吸引して、メディアを削除します。 10ミリリットルのPBSを簡単に追加LYし、洗浄ステップを完了するために吸引して除去します。
- PMEFからMES細胞を分離するために、トリプシン/ EDTA（3ミリリットル/皿、StemCell Technologies）を0.25％を追加して、プレートからの幹細胞とPMEFデタッチされるまで37℃で3〜5分間インキュベートする。コロニー（約15-20倍）を破るには、上下LIFおよびピペット細胞なしで15ミリリットル新鮮なESのメディアを追加します。その後、0.1％ゼラチンでコーティングされたT150フラスコに追加して、37℃で30分間インキュベート℃、 ES細胞は、フローティングでなければなりませんしながらインキュベートした後、PMEFはゼラチン表面に添付しなければなりません。 50 mlチューブに浮遊MES細胞を収集します。
- （ 表1のレシピを参照してください）神経分化培地の10ml中に800回転と再懸濁した細胞でスピンダウンする。
- 血球計算板を用いて細胞数をカウントし、プレート100 mmの細菌または懸濁液を培養皿の上に約2×10 6 MES細胞。これらのプレートは、懸濁培養の成長を許可し、胚様体（EBS）の形成を推進しています。
- 差異にる1日目は、MESの細胞は光学顕微鏡下に表示されている小さな浮遊凝集体（EBS）を形成する。任意のキャリーPMEFは皿に添付してください。 3分間低速（500 rpm）で15 mlのチューブと遠心分離機に懸濁細胞とメディアを転送します。慎重に培地を吸引除去する、新たな細菌の皿にプレートの細胞をペレット化しEBSに新鮮な神経分化培地10mlを追加し、。メディアの補充に加えて、このステップは、前のステップから引き継がれ、任意のPMEFを削除します。
- 分化2日目に、EBは運動ニューロンに誘発される準備が整いました。
3。ステップ3：運動ニューロン仕様（タイミング：5日間）
- 分化2日目、スワール培養皿上で、15 mlチューブにメディアとEBSを転送します。 EBを重力（〜10分）または3分間低速（500 rpm）で遠心分離によって沈殿しましょう。
- （レシピを参照してくださいにおける運動ニューロンの分化の10ミリリットル（MND）培地で注意深く再懸濁したEB培地を吸引
- 直径200μmの強力なGFPシグナル（ 図1C）を発現すべき-分化7日目に、EBは約150である必要があります。これらのEBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングされた料理やカバースリップの上に分離し、めっきする準備が整いました。
4。ステップ4：Poly-DL-ornithine/lamininコーティングカバーガラスの調製（タイミング：2日間）
二日EBS（分化5日目にIE）を解離する前に、poly-DL-ornithine/laminin-coatedカバースリップを準備します。
- 場所24ウェルプレートの底部に12mmの円形のカバー（ワーナー·インスツルメンツ）。 10Xストック溶液（1 mg / ml）を取得するには25mgを25ミリリットルのポリ-DL-オルニチン（Sigma-Aldrich）を、滅菌蒸留水（D 2 H 2 O）を溶解する。するときに使用する準備ができて、コンセントを取得するために、D 2、H 2 Oでポリ-DL-オルニチンの1/10希釈を作る100μg/ mlの比。一晩4℃、24ウェルプレートとインキュベートの各ウェル℃に0.5ミリリットルを追加します。
- 次の日（分化6日目）、吸引ポリ-DL-オルニチンおよび組織培養フード内プレートとカバースリップは、空気乾燥させます。 D 2 H 2 Oで三回プレートのウェルを洗浄します。別の時間空気乾燥してみましょう。
- 100×ストック溶液（200μg/ mlの）を作るために氷冷した1×PBS 5 mlに1 mgのマウスラミニン（ミリポア社製）を溶解する。するときに使用する準備ができて、アイス冷1X PBS（2μgのラミニン/ ml）を1/100希釈してください。 0.5ミリリットルを追加/ウェル4の24ウェルプレートとインキュベート℃、一晩のために。細胞を播種する前に、過剰なラミニンを削除する必要があり、井戸は、1X PBS 2回すすいだ。カバースリップは、MND培地（0.5ミリリットル/ウェル）に格納することができます。
5。ステップ5：軸索伸長（タイミング：2日間）
- 分化7日目に、（約3分）を15 mlのチューブにEBを収集し、EBを解決することができます。吸引メディアと再秒PBSでuspendのEB。 EBを解決し、その後PBSを吸引することができます。このステップを3回繰り返します。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートし、EBSにアキュマックス（ミリポア社製）1mlを追加します。その後、EBを覆う過剰ACCUMAXを吸引除去する。
- EBを解除するには、MNDの培地3mlを追加します。 EBを混乱させる1ミリリットルエッペンドルフピペット（ブルーチップ）を使用して、ピペットを上下に20回。室温で2分間インキュベートします。単一細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーキャップ（BDファルコン）で12x75 mmのチューブに細胞懸濁液を転送します。単一細胞の収率を豊かにするようにフィルターに保持され、残りの塊と細胞とは、この解離のステップを繰り返します。最終的に単一の細胞懸濁液は、6ミリリットルになります。
- 穏やかに、この単一の細胞懸濁液を混合し、血球計算板を用いて細胞をカウントします。 ml当たり2×10 5細胞の密度にMND培地（10各BDNFのng / mlで、GDNF、CNTF、およびNT-3添加）に細胞を希釈します。 POを含む24ウェルプレートに細胞懸濁液（0.5ミリリットル/ウェル）を追加ly-DL-ornithine/lamininコーティングしたカバーガラス（上記のように事前に準備された）。分化した細胞は、培養中の2日間（ 図1D）の後に長い神経突起を拡張します。
6。代表的な結果
図1Aは、プロトコルの概要を示します。ステップ1では、MESの細胞がPMEFで栽培されており、自発的な分化を防止するためにLIFを添加した。一般に、未分化のMESコロニーは円形、コンパクトであり、明らかにエッジを定義しています。コロニーは互いに接触していない。典型的には、MESの細胞は、1:4の比毎に2〜3日で分割する必要があります。しかし、個々の細胞株は、異なる速度で成長し、スプリット比は、経験的に決定する必要があります。 図1Bの矢印は3日間PMEFフィーダー層上で培養後、MES細胞の典型的な外観を示しています。これらのコロニーは大きく（直径50〜100μmの）まだラウンドと定義された優位性を維持だ。この段階ではコロニーは、分化や継代培養するための準備が整いました。 図1Bの矢印は、通常、めっき後24時間を見つけること小さなMESのコロニーを示しています。めっき後の4日間は、MESの細胞が生い茂っになります。彼らは差別化し始めていることを示し、平坦な外観と定義された境界の損失を示しています。このような細胞は、神経細胞への分化に適していません。
運動ニューロンにMESの細胞を区別するには、MESの細胞はEBの形成を可能にするためにサスペンションの条件で栽培する必要があります。ステップ2では、ES細胞はEBの形成を促進するためのフィーダー層なしで培養表面に転写されています。このステップでは、彼らは神経系統に直接細胞への2日間ノギン、bFGFを、とFGF-8を添加した神経分化培地中でインキュベートされる。小さなEBは、分化の1日目で顕微鏡下で観察することができます。彼らは、培地中に浮遊する必要があります。キャリーPMEFも1日目で見つけることができます分化、削除する必要があります。これらの細胞は、EBSが新しい細菌の皿に継代されたときように排除される細菌の料理に準拠しています。従って、分化の2日目で、ほとんどまたはまったくPMEFは、培養皿の中で見られるべきである。ステップ3では、新しい料理にEBの継続的な転送が残っているPMEFの除去を確認する必要があります。 EBは運動ニューロンに細胞を区別するために5日間のRAとSAGを添加した運動ニューロンへの分化（MND）培地中で培養されています。培養中に、EBのサイズが成長し続けると分化3日目〜4で肉眼で見ることができます。 図1Cは、分化7日目のEBの微視的な外観を示しています。未分化細胞とは異なり、EBは、GFPの発現に起因する強い蛍光を示しています。これらのEBは最適に区別され、解離のために準備が整いました。フローサイトメトリーは、51％±解離EBからの細胞の0.8％が細胞に5を発現している GFPに分化したことを示した。ステップ5番目の文化の中でGDNF、CNTF、BDNF、長い軸索突起の延長でNT3結果の存在下でESE運動ニューロンは、 図1Dは、2日間解離EBのめっき後の分化した細胞の外観を示す。メッキ細胞の細胞体から伸びる長い突起に注意してください。免疫蛍光染色は、GFP +細胞は汎神経マーカー（ニューロフィラメント中規模チェーン）と二つの運動ニューロン特異的マーカー、（膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼは、 図2）を発現することを示しています。
図1：運動ニューロン（写真はWu らから変更しました。5）にMES細胞の分化。 MESの細胞から運動ニューロンへの分化プロトコルのA）スキーム。 B）未分化MES細胞は線維芽細胞フィーダー層の上に円形コロニーを形成します。彼らは弱いGFP発現しています。 C）MESの細胞はフィーダー層とcultuから分離されたEBを形成する低添付皿に赤い。分化過程の最初の2日間、細胞を50 ng / mlのノギン、20 ng / mlのbFGFを、20 ng / mlのFGF-8にさらされた。その後、彼らは1μMレチノイン酸と5日に1μMソニックザヘッジホッグアゴニストSAGと区別するために誘導した。分化したMESの細胞は強いGFPの蛍光を表明した。 D）7日間分化した後、EBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングプレート上で分離し、播種した。分化した細胞は、培養2日後に長い神経突起を伸ばし。スケールバー= 200μmである。 MN =運動ニューロン。 A、B、CおよびDは、明視野像であり、B '、C'とD 'は、対応する蛍光画像である。
図2。MES細胞由来の運動ニューロンのキャラクタリゼーション。フィラメント媒体チェーン（NF-M、赤）、チャット（赤）、および膵島-1（赤）の免疫蛍光染色は、GFP（緑色）がexprと一致したession。 DAPI（青色）が核を識別するために使用されていました。スケールバー=50μmである。
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Discussion
MES細胞の質が運動ニューロンの効率的な生成のための最も重要なパラメータです。 MESの細胞は、自発的な分化を防止するためにPMEFで栽培する必要があります。 LIFの添加により、未分化状態のMES細胞を維持するのに役立ちます。 MESの細胞はすべての12から15時間を分割するので、培地は急速に枯渇し、毎日交換する必要がありますとなります。
ソニックヘッジホッグ経路の効率的な活性化が運動ニューロンの仕様を誘導するために必要な重要なパラメータです。 SHHタンパク質（R＆Dシステム）、およびHhのアゴニストHhAg1.3（Curis社）、purmorphamine（Calbiochem社）、およびSAG（EMDケミカルズ）などShhのシグナル伝達アゴニストは、すべての運動ニューロン1-3の形成を促進するために使用されている、10,11。我々はモーターニューロン表現型5に向かって細胞を分化におけるpurmorphamineより効果的な分子であることがサグが見つかりました。 1 - RAが20％以上の分化効率を与えたことはない1μM、2.5μMのpurmorphamine。しかしながら私たちの手の中にRAの1μMとSAGの1μMの組み合わせは、神経誘導を行うことなく手続きの約25％の分化効率を与えた。
さらに、分化の効率を向上させるため、我々は、前の運動ニューロンの仕様のステップに2日間の神経誘導ステップを追加します。このアプローチは、胚細胞は、まず神経系6-9を入力すると、ノギンとFGFの両方のシグナルが神経誘導の初期段階に重要であるという事実を利用しています。神経誘導に加えて、FGFシグナリングは神経前駆細胞としての文化を維持しています。開発中脳におけるFGF8の過剰発現は脳室帯12の神経前駆人口の劇的な拡大につながります。 FGFのとノギンの組み合わせは、後部神経アイデンティティー9を促進することにより、神経組織の形成を誘導することで相乗的に作用する。したがって、2日間の神経誘導のステップは、向かってMES細胞を指示するように設計されています運動ニューロン仕様のプロセスの開始前に神経系統。
ここで説明するプロトコルは、以前は1で述べた元の確立されたプロトコルの改良と拡張したものです。運動ニューロンを生成するタイムラインは同じですが、我々は、手順を合理化し、運動ニューロンの収率を向上させるための変更の数を加えた。分化プロトコルに神経誘導ステップを追加することによって、我々は25％から50％への分化効率を高めることができます。我々のプロトコルは、MESの細胞に由来する運動ニューロンを豊かにするための効率的なアプローチを提供します。運動ニューロンは、SMAの患者から得られたとSMAマウス由来の一次運動ニューロンの貧しい人々の健康には十分な数量、品質、この疾患に影響を受けたタンパク質の定量分析を実行するために、純度の細胞の単離を排除することはできません。このMESのセルプロトコルを使用して、我々は十分な量子の運動ニューロンの細胞集団を得ることができた脊髄性筋萎縮症5で影響を受けた分子経路を特定するためのプロテオミクス研究のためのティティと純度。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この原稿は2011年5月26日に亡くなった博士Wenlan王の記憶に捧げられています。我々は寛大に本研究で用いたHBG3 MES細胞を提供するために博士はダグラスA.カーに感謝します。この作品は、ヌムールによって資金を供給され、研究資源のナショナルセンター（NCRR）、およびセンターをサポートするNCRRからCOBRE助成賞（5 P20 RR020173-05）のINBREプログラムの下で助成金（2 RR016472-10）子供たちは、ウィルミントン、デラウェア州、アメリカ合衆国のためにアルフレッドI.デュポン病院で小児研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
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