Summary
Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, de etiologische bewerker van humane tuberculose, heeft een buitengewone vermogen om te overleven tegen milieu-invloeden zoals antibiotica. Hoewel stress tolerantie van M. tuberculose is een van de te verwachten bijdragen aan de 6-maanden durende chemotherapie van tuberculose 1, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze karakteristieke fenotype van de ziekteverwekker nog onduidelijk. Veel micro-organismen zijn geëvolueerd om in stressvolle omgevingen overleven door zelf-assemblage in zeer georganiseerd bevestigd, oppervlakte, en matrix ingekapselde structuren, genaamd biofilms 2-4. Groei gemeenschappen blijkt een voorkeursuitvoeringsvorm overlevingsstrategie van microben en wordt bereikt door genetische elementen die oppervlakte bijlage, intercellulaire communicatie en synthese van extracellulaire polymeren (EPS) 5,6 regelen. De tolerantie van ecologische stress wordt waarschijnlijk mogelijk gemaakt door EPS, en misschien door de physiologische aanpassing van de individuele bacillen om heterogene micro-omgevingen binnen de complexe architectuur van biofilms 7.
In een reeks van recente papers hebben we vastgesteld dat M. tuberculose en Mycobacterium smegmatis een sterke neiging om te groeien in georganiseerde multicellulaire structuren genoemd biofilm, dat kan verdragen meer dan 50 maal de minimale remmende concentraties van anti-tuberculose middelen isoniazide en rifampicine 8-10. M. tuberculose, echter intrigerend vereist specifieke voorwaarden voor het vormen van volwassen biofilms, met name verhouding van 9:1 van de headspace: media en beperkte uitwisseling van lucht met de atmosfeer 9. Eisen die bijzondere milieu-omstandigheden zou kunnen worden gekoppeld aan het feit dat M. tuberculose is een obligaat humaan pathogeen en dus heeft aangepast aan weefsel omgevingen. In deze publicatie tonen we aan methoden voor het kweken van M. tuberculosebiofilms in een fles en een 12-wells plaat formaat dat geschikt voor bacteriologische en genetische studies. We hebben de protocol voor verzwakte stam M. tuberculose, mc 2 7000, met een deletie in de twee loci, panCD en RD1, die essentieel zijn voor in vivo kweken van de bacterie 9. Deze soort kan veilig gebruikt worden in een BSL-2 insluiting voor het begrip van de fundamentele biologie van de tuberculose-pathogeen zo te voorkomen aan het vereiste van een dure BSL-3 faciliteit. De methode kan worden uitgebreid, met de nodige wijzigingen in de media, om biofilm van andere mycobacteriële kweekbare soorten groeien.
In het algemeen zal een uniform protocol van het kweken van mycobacteriële biofilms te helpen de onderzoekers geïnteresseerd in het bestuderen van de basis-elastische eigenschappen van mycobacteriën. Daarnaast zal een duidelijke en beknopte wijze te groeien mycobacteriële biofilms ook helpen de klinische en farmaceutische investigators de werkzaamheid van een potentieel geneesmiddel.
Protocol
1. Groeiende biofilms van M. tuberculose in een 250mL schroef afgesloten fles
- Media voorbereiding: Los 0,5 g KH 2 PO 4, 0,5 g van MgSO 4, 4g van L-Asparagine, 2g van citroenzuur, 0,05 g van de IJzer ammoniumcitraat, 60 ml van glycerol in 900 ml water. Breng de pH op 7,0 met NaOH. Autoclaaf koel en vlak voor aanvang van de proef, steriele ZnSO 4 toe tot een eindconcentratie van 0,1% w / v. Sinds mc 2 7000 is een pantothenaat auxotroph deze stam vereist ook pantotheenzuur op 10μg/mL van de uiteindelijke concentratie.
Opmerking: Dit is een standaard samenstelling van Sauton de media gebruikt voor M. tuberculosis. Indien nodig andere specifieke media worden gebruikt voor andere mycobacteriële species.
- Inoculums voorbereiding: Grow M. tuberculose in 7H9OADC met 0,05% Tween-80 een week of OD 600 van 0,7 tot 1,0. De culture kan direct gebruikt worden als entmateriaal een 1:100 verdunning.
- Breng 25 ml van Sauton de media om een 250mL schroef bedekte polystyreen fles (Corning). Voeg 250μl van het inoculum aan het medium, dop van de fles zeer strak en leg hem ongestoord in een vochtige 37 ° C incubator voor 3 weken. Let op de fles eenmaal per dag ervoor te zorgen dat geen besmetting.
- Aan het einde van de derde week, draait u de dop van het flesje voor de verdere groei van M. toe tuberculose op de interface. Als het deksel niet los dit stadium wordt de onvoldoende zuurstof concentratie in de container vertragen verdere groei van bacteriën.
2. De groei van M. tuberculose biofilms in 12-well platen
- Bereid de media en inoculum van mc 2 7000, zoals beschreven in delen A1 en A2.
- Meng 60 ml van media met 600μl van inoculum. Breng 4,5 mL van het mengsel in elke well van de plaat. Bedek de plaat met deksel. Wikkel de plaat een paar keer met parafilm. Incubeer de plaat ongestoord bevochtigde incubator bij 37 ° C van 5 weken heeft.
3. Het bepalen van de frequentie van het geneesmiddel tolerante persisters in M. tuberculose biofilms
- Grow M. tuberculose biofilms in een 12-well formaat zoals beschreven in paragraaf B. Dit zal een totaal van ongeveer 5-weken.
- Zodra de biofilm rijpen (na 5 weken incuberen) injecteren keuze van antibioticum op de gewenste concentratie in de media onder de biofilm met een microtip in een pipet.
Opmerking: Het volume van de media onder de pellicles vermindert tot ongeveer 3.0mL. Dus onderzoekers dient dienovereenkomstig te berekenen van de hoeveelheid van het geneesmiddel.
- Werveling de plaat voorzichtig zodat het antibioticum grondig wordt verspreid in het medium. Voor de statistisch significante resultaten, injecteer de antibioticaotic vier putten. Parallel, injecteer de dezelfde hoeveelheid oplosmiddel waarin het antibioticum werd opgelost in andere vier putten, en laat de laatste vier putten van onaangeroerd de plaat. Bedek het bord met deksel en zet frisse lagen van parafilm rond de plaat. Zet het terug in de incubator voor de gewenste periode.
- Aan het einde van de incubatie open plaat en voeg Tween-80 de uiteindelijke concentratie van 0,1% (volume / volume) in ieder van de putten. Swirl de hele plaat zachtjes uniforme verspreiding van het wasmiddel. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Meng de inhoud van elke goed met een pipet een paar keer zodat de gehele inhoud kunnen gelijkmatig worden overgedragen aan een 15 ml conische buis.
- Spin down van de inhoud van de buis bij 4000rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De pellet in 5 ml verse wasbuffer (PBS met 10% glycerol en 0,05% Tween-80). Herhaal het wassen drie keer. Resuspendeer de pellet in 5 ml wasbuffer. Houd het op de wip voor de overnight bij 4 ° C.
Opmerking: Hoewel lage temperatuur werd oorspronkelijk ontwikkeld voor M. smegmatis (tot de groei te minimaliseren tijdens de dispersie) en gebruikt voor M. tuberculosis en de langzaam groeiende soorten kunnen waarschijnlijk worden geschud bij kamertemperatuur zonder enige impact op het resultaat. Schommelen bij kamertemperatuur kan nodig zijn als die in BSL-3 faciliteit.
- Bereid een steriele injectiespuit voorzien van microtip (2-200μl) door te snijden zijn brede einde te maken aan de juiste maat, passend aan de spuit en te verpakken met parafilm. Voer de gehele inhoud van de buis door de tip-gemonteerde spuit en verzamelen in een verse 15 ml buizen. Herhaal deze stap 5 tot 6 keer tot je nemen een vrij homogene suspensie.
- Bereid seriële verdunningen van de suspensie en de plaat verdunningen op 7H11OADC plaat om het aantal levensvatbare kolonies in elk putje bepalen. Incubeer de platen gedurende drie weken in 37 ° C incubator. Bepaal de frecy van persisters de biofilm populatie door de verhouding van het aantal kolonies verkregen antibiotica behandeld met deze verkregen op oplosmiddel behandelde platen.
4. Representatieve resultaten
Wanneer gekweekt in een fles groei van M. tuberculose te zien in de bodem van de fles aan het einde van de eerste week. Aan het einde van de tweede week, fragmentarisch groei van bacteriën in de lucht-media interface te zien, hoewel de groei van de lucht-media interface vaste zichtbaar aan het einde van de derde week (Fig. 1A). Op dit moment de bevestiging van de bacteriën op de wand van de houder wordt waargenomen. Vanaf dit punt de groei van de cultuur gebeurt vooral op de lucht-media-interface. De vloeistof onder het oppervlak groei duidelijk. Typisch is de structuur rijpt het einde van het vijfde week (Fig. 1B). Als incubatie wordt verlengd, zullen de structuren gaan zinken naar de bodem van de houder. Intrigerendaanscherping van de kap tot het einde van de derde week is een belangrijke stap in het proces, en om onbekende redenen een losse bedekte fles aanzienlijk vertraagt start van de groei op de interface 9.
In de 12-well formaat, wordt een robuuste biofilm op het lucht-media interface gezien in ieder van de putten eind van vijf weken (fig. 2A). Als de platen zijn niet volledig ingepakt dan differentieel biofilm groei wordt waargenomen. In het ergste geval kunnen aanzienlijke media verdamping kraam de groei van de bacteriën (Figuur 2B). Zo wikkelen van de plaat is noodzakelijk om de verdamping te voorkomen en om omgeving voor biofilmvorming (zie vorige paragraaf).
Het aantal levensvatbare bacillen in biofilms bepaald met deze techniek is vrij reproduceerbaar is. Reactie van M. tuberculosis biofilms afhankelijk van de aard van de antibiotica. Voor een bactericide antibioticum zoals rifampicine, verlies levensvatbaarheid volgens een bipha sic trend 9. Een snelle daling van de levensvatbaarheid gedurende de eerste drie tot vier dagen, gevolgd door een blijvende fase waarin een klein percentage van de bevolking blijft volledig afbreekbare antibiotica onafhankelijk van de concentratie van het antibioticum of de blootstellingsduur. Figuur 3 toont het aantal levensvatbare bacillen in volwassen biofilm na 7 dagen blootstelling aan 50μg/mL (50 keer hoger dan de MIC) van rifampicine.
Figuur 1A. Vroege verschijning van M. tuberculose bacillen in de lucht-media-interface van de bacteriën na 3 weken van de incubatie.
Figuur 1b. Gerijpt biofilms van M. tuberculose op de lucht-media-interface na vijf weken van de incubatie.
820/3820fig2A.jpg "/>
Figuur 2A. 5-weken oude biofilms van M. tuberculose gekweekt in 12-well formaat.
Figuur 2B. Een mislukte poging om M. tuberculosis biofilms te groeien in 12-wells plaat zonder parafilm.
Figuur 3. Een vertegenwoordiger grafiek die de frequentie van het geneesmiddel tolerante persisters in M. tuberculose biofilms gekweekt in 12-well formaat en worden blootgesteld aan rifampicine 50μg/mL gedurende zeven dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberculose (TB), veroorzaakt door de infectie van Mycobacterium tuberculosis, blijft een grote bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid. Bijna een derde van de wereldbevolking wordt geschat op asymptomatisch besmet raakt met het pathogeen, ongeveer 9 miljoen nieuwe gevallen verschijnen in kliniek elk jaar met symptomen van actieve tuberculose en ongeveer 1,7 miljoen mensen sterven van de infectie elk jaar 11. De enorme last van de ziekte wordt vooral bijgedragen door het ontbreken van een vaccin en een zeer gecompliceerde chemotherapie dat een multi-regime toegediend gedurende zes tot negen maanden houdt. De langdurige chemotherapie is grotendeels toe te schrijven aan fenotypische tolerantie van een kleine subpopulatie van de ziekteverwekker die nodig is langdurige blootstelling van antibiotica 12. Terwijl die op deze persisters is van cruciaal belang voor de korte en effectieve behandeling van tuberculose, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van deze persisters blijven onduidelijk.
De meeste microbiële species in hun natuurlijke omgeving spontaan groeien in zelf-geassembleerde, oppervlakte bijgevoegde meercellige gemeenschappen genoemd biofilms, die zeer tolerant voor antibiotica 3. Recent is aangetoond dat verschillende mycobacteriële species sterke neiging om in vitro groeien biofilm, die een micro dat de ontwikkeling van geneesmiddelen tolerante persisters 9,13-15 bevorderen voorzien zijn. Terwijl de snel groeiende milieu-soorten, zoals M. smegmatis kunnen gemakkelijk vormen biofilms in detergent-vrije media, de langzaam groeiende pathogene soorten M. tuberculose vereisen specifieke voorwaarden vormen de meercellige structuren 9. Omdat het kweken van M. tuberculose in biofilms kunnen zorgen voor een significante inzicht in de mechanismen van tolerantie en doorzettingsvermogen, de verspreiding van een gedetailleerd protocol voor het kweken van de bacterie in biofilms door middel van een open source zal waardevol zijn voor tuberculose onderzoek, met name in een resource-beperkte landnummery.
Hier beschrijven kweekmethode M. tuberculose in biofilms in detail. We bieden ook een protocol bij de biofilms te breken en het aantal levensvatbare bacillen te bepalen in de populatie. Deze techniek kan worden gebruikt om het aantal geneesmiddel tolerant persisters in de cultuur te bepalen. De drie meest kritische stappen in het kweken van biofilms zijn: 1) de keuze van een geschikt reinigingsmiddel-vrije media, gesloten cultuur container tijdens de eerste drie weken, en open afvalcontainer voor incubatie. Bovendien om de container in een bevochtigde toestand is ook kritisch om verdamping van media te voorkomen gedurende 5 weken incuberen. Dit kan aanzienlijk bemoeilijken de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd uitgevoerd met financiële steun van het Nationaal Instituut voor Gezondheid en American Lung Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C.
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L.
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
