Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms
Summary
Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, de etiologische bewerker van humane tuberculose, heeft een buitengewone vermogen om te overleven tegen milieu-invloeden zoals antibiotica. Hoewel stress tolerantie van M. tuberculose is een van de te verwachten bijdragen aan de 6-maanden durende chemotherapie van tuberculose 1, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze karakteristieke fenotype van de ziekteverwekker nog onduidelijk. Veel micro-organismen zijn geëvolueerd om in stressvolle omgevingen overleven door zelf-assemblage in zeer georganiseerd bevestigd, oppervlakte, en matrix ingekapselde structuren, genaamd biofilms 2-4. Groei gemeenschappen blijkt een voorkeursuitvoeringsvorm overlevingsstrategie van microben en wordt bereikt door genetische elementen die oppervlakte bijlage, intercellulaire communicatie en synthese van extracellulaire polymeren (EPS) 5,6 regelen. De tolerantie van ecologische stress wordt waarschijnlijk mogelijk gemaakt door EPS, en misschien door de physiologische aanpassing van de individuele bacillen om heterogene micro-omgevingen binnen de complexe architectuur van biofilms 7.
In een reeks van recente papers hebben we vastgesteld dat M. tuberculose en Mycobacterium smegmatis een sterke neiging om te groeien in georganiseerde multicellulaire structuren genoemd biofilm, dat kan verdragen meer dan 50 maal de minimale remmende concentraties van anti-tuberculose middelen isoniazide en rifampicine 8-10. M. tuberculose, echter intrigerend vereist specifieke voorwaarden voor het vormen van volwassen biofilms, met name verhouding van 9:1 van de headspace: media en beperkte uitwisseling van lucht met de atmosfeer 9. Eisen die bijzondere milieu-omstandigheden zou kunnen worden gekoppeld aan het feit dat M. tuberculose is een obligaat humaan pathogeen en dus heeft aangepast aan weefsel omgevingen. In deze publicatie tonen we aan methoden voor het kweken van M. tuberculosebiofilms in een fles en een 12-wells plaat formaat dat geschikt voor bacteriologische en genetische studies. We hebben de protocol voor verzwakte stam M. tuberculose, mc 2 7000, met een deletie in de twee loci, panCD en RD1, die essentieel zijn voor in vivo kweken van de bacterie 9. Deze soort kan veilig gebruikt worden in een BSL-2 insluiting voor het begrip van de fundamentele biologie van de tuberculose-pathogeen zo te voorkomen aan het vereiste van een dure BSL-3 faciliteit. De methode kan worden uitgebreid, met de nodige wijzigingen in de media, om biofilm van andere mycobacteriële kweekbare soorten groeien.
In het algemeen zal een uniform protocol van het kweken van mycobacteriële biofilms te helpen de onderzoekers geïnteresseerd in het bestuderen van de basis-elastische eigenschappen van mycobacteriën. Daarnaast zal een duidelijke en beknopte wijze te groeien mycobacteriële biofilms ook helpen de klinische en farmaceutische investigators de werkzaamheid van een potentieel geneesmiddel.
Protocol
Discussion
Tuberculose (TB), veroorzaakt door de infectie van Mycobacterium tuberculosis, blijft een grote bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid. Bijna een derde van de wereldbevolking wordt geschat op asymptomatisch besmet raakt met het pathogeen, ongeveer 9 miljoen nieuwe gevallen verschijnen in kliniek elk jaar met symptomen van actieve tuberculose en ongeveer 1,7 miljoen mensen sterven van de infectie elk jaar 11. De enorme last van de ziekte wordt vooral bijgedragen door het ontbreken van een vacc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd uitgevoerd met financiële steun van het Nationaal Instituut voor Gezondheid en American Lung Association.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
