Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis, de etiologische bewerker van humane tuberculose, heeft een buitengewone vermogen om te overleven tegen milieu-invloeden zoals antibiotica. Hoewel stress tolerantie van M. tuberculose is een van de te verwachten bijdragen aan de 6-maanden durende chemotherapie van tuberculose ^1, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze karakteristieke fenotype van de ziekteverwekker nog onduidelijk. Veel micro-organismen zijn geëvolueerd om in stressvolle omgevingen overleven door zelf-assemblage in zeer georganiseerd bevestigd, oppervlakte, en matrix ingekapselde structuren, genaamd biofilms ^2-4. Groei gemeenschappen blijkt een voorkeursuitvoeringsvorm overlevingsstrategie van microben en wordt bereikt door genetische elementen die oppervlakte bijlage, intercellulaire communicatie en synthese van extracellulaire polymeren (EPS) ^5,6 regelen. De tolerantie van ecologische stress wordt waarschijnlijk mogelijk gemaakt door EPS, en misschien door de physiologische aanpassing van de individuele bacillen om heterogene micro-omgevingen binnen de complexe architectuur van biofilms ^7.

In een reeks van recente papers hebben we vastgesteld dat M. tuberculose en Mycobacterium smegmatis een sterke neiging om te groeien in georganiseerde multicellulaire structuren genoemd biofilm, dat kan verdragen meer dan 50 maal de minimale remmende concentraties van anti-tuberculose middelen isoniazide en rifampicine ^8-10. M. tuberculose, echter intrigerend vereist specifieke voorwaarden voor het vormen van volwassen biofilms, met name verhouding van 9:1 van de headspace: media en beperkte uitwisseling van lucht met de atmosfeer ^9. Eisen die bijzondere milieu-omstandigheden zou kunnen worden gekoppeld aan het feit dat M. tuberculose is een obligaat humaan pathogeen en dus heeft aangepast aan weefsel omgevingen. In deze publicatie tonen we aan methoden voor het kweken van M. tuberculosebiofilms in een fles en een 12-wells plaat formaat dat geschikt voor bacteriologische en genetische studies. We hebben de protocol voor verzwakte stam M. tuberculose, mc ² 7000, met een deletie in de twee loci, panCD en RD1, die essentieel zijn voor in vivo kweken van de bacterie ^9. Deze soort kan veilig gebruikt worden in een BSL-2 insluiting voor het begrip van de fundamentele biologie van de tuberculose-pathogeen zo te voorkomen aan het vereiste van een dure BSL-3 faciliteit. De methode kan worden uitgebreid, met de nodige wijzigingen in de media, om biofilm van andere mycobacteriële kweekbare soorten groeien.

In het algemeen zal een uniform protocol van het kweken van mycobacteriële biofilms te helpen de onderzoekers geïnteresseerd in het bestuderen van de basis-elastische eigenschappen van mycobacteriën. Daarnaast zal een duidelijke en beknopte wijze te groeien mycobacteriële biofilms ook helpen de klinische en farmaceutische investigators de werkzaamheid van een potentieel geneesmiddel.

Protocol

1. Groeiende biofilms van M. tuberculose in een 250mL schroef afgesloten fles

1. Media voorbereiding: Los 0,5 g KH ₂ PO _4, 0,5 g van MgSO _4, 4g van L-Asparagine, 2g van citroenzuur, 0,05 g van de IJzer ammoniumcitraat, 60 ml van glycerol in 900 ml water. Breng de pH op 7,0 met NaOH. Autoclaaf koel en vlak voor aanvang van de proef, steriele ZnSO ₄ toe tot een eindconcentratie van 0,1% w / v. Sinds mc ² 7000 is een pantothenaat auxotroph deze stam vereist ook pantotheenzuur op 10μg/mL van de uiteindelijke concentratie.

Opmerking: Dit is een standaard....

Discussie

Tuberculose (TB), veroorzaakt door de infectie van Mycobacterium tuberculosis, blijft een grote bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid. Bijna een derde van de wereldbevolking wordt geschat op asymptomatisch besmet raakt met het pathogeen, ongeveer 9 miljoen nieuwe gevallen verschijnen in kliniek elk jaar met symptomen van actieve tuberculose en ongeveer 1,7 miljoen mensen sterven van de infectie elk jaar ^11. De enorme last van de ziekte wordt vooral bijgedragen door het ontbreken van een vacc.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyreen cultuurflessen	Fisher Scientific	03-374-300
12-wells weefselkweekplaat	VWR international	62406-165
50-mL conische buizen	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatografische koelkast	VWR international	55702-520
petrischaal	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasisch)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citroenzuur	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferriammoniumcitraat	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantotheenzuur	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9-bouillon	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC-verrijking	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250 mL voorraadfles	Corning	430281
12-wells platen	Falcon BD	353043
rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10 mL spuit	BD Biosciences	301604
1-200μL pipetpunten	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15 mL centrifugebuis	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11-agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasisch)	Sigma-Aldrich	S0876-500G