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Immunology and Infection

हरपीज के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति सिस्टम वायरस लेटेंसी और पुनर्सक्रियण सिंप्लेक्स

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

प्रोटोकॉल एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल प्रणाली के अध्ययन दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) विलंबता और पुनर्सक्रियन का वर्णन करता है. परख समरूप सहानुभूति न्यूरॉन संस्कृतियों को रोजगार और वायरस न्यूरॉन शाही सेना के हस्तक्षेप और पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित उपकरणों की एक किस्म का उपयोग कर बातचीत की आणविक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. अलगाव और चूहा भ्रूण से एससीजी न्यूरॉन्स की संस्कृति

इस प्रोटोकॉल को समझने के लिए एक उपयोगी संदर्भ प्रदान करते हैं, और पहले साहित्य का एक व्यापक चर्चा के लिए कि एससीजी न्यूरॉन संस्कृति की स्थापित तरीकों सहित इन विट्रो संस्कृति, थाली कोटिंग substrates, और सीरम स्वतंत्र मीडिया के घटकों में एससीजी के लिए आधार, पाठक 2-4 संदर्भों को संदर्भित किया जाता है.

  1. एससीजी न्यूरॉन्स के लिए एक स्रोत के रूप में चूहों का उपयोग NIH के दिशा निर्देशों के अनुसार में एक सक्रिय संस्थागत पशु की देखभाल और समिति का प्रयोग करें (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया.
  2. विच्छेदन शुरू होने से पहले कोलेजन और लेपित laminin 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति व्यंजन तैयार करते हैं. Pipetting मल्टी चैनल डिवाइस का उपयोग, 0.66 मिलीग्राम / एमएल चूहे की पूंछ कोलेजन युक्त समाधान के साथ सभी 96 कुओं को भरने. तुरंत कोलेजन है, जो और बरामद किया जा सकता है की 8 dissections के लिए इस्तेमाल किया हटा दें. टी हटाने के बादवह कोलेजन, यह बहुत महत्वपूर्ण है एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत सूखे कुओं जाने. समय की राशि के लिए सूखी लेता पकवान में कुओं की संख्या पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, यह आम तौर पर लगभग 5-10 मिनट लगते हैं. एक साथ 96 के लिए सूखी पकवान में कुओं के लिए, लेकिन 30 से ऊपर ले जा सकते हैं - 40 मिनट अगर एक बड़ा स्वरूप 24 अच्छी तरह से पकवान प्रयोग किया जाता है. विफलता ठीक से गरीब एससीजी लगाव में कुओं परिणाम सूखी. फिर 2 μg / मिलीलीटर laminin के समाधान का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएँ. 37 ° सी humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में कम से कम 2 घंटे के laminin समाधान सेते हैं जब तक आप अपने न्यूरॉन्स (1.14 कदम) थाली करने के लिए तैयार हैं.
  3. सीओ 2 का उपयोग व्यावसायिक रूप से प्राप्त गर्भवती मादा चूहों euthanized हैं. 70% इथेनॉल के साथ शव का छिड़काव करने के बाद, एक यू के आकार का चीरा पेट के आसपास किया जाता है. वापस त्वचा छीलने के बाद, एक दूसरे यू के आकार का चीरा पेट की मांसपेशियों दीवार के माध्यम से किया जाता है. गर्भाशय पेट की मांसपेशियों परत उठाने पर दिखाई देता है. गर्भाशय और एक 15 में जगह निकालेंसेमी पकवान. ध्यान से कुंद कैंची का उपयोग करने के लिए भीतर पिल्ले हानिकारक से बचने के गर्भाशय खुला. प्रत्येक पिल्ला अपनी भ्रूण थैली से जारी किया जाना चाहिए, गर्भनाल कटे, और पिल्ला 70% इथेनॉल और Kimwipes के साथ साफ.
  4. एक विच्छेदन हुड पर कार्य करना, धड़ से सिर के बाल काटना द्वारा अजन्मे E21 चूहा पिल्ले बलिदान. बस, कंधे के ऊपर गर्दन के आधार पर कैंची निशाना लगाओ. Ganglia बेनकाब करने के लिए, नीचे सिर (ऊपर गर्दन की ओर) तीन स्थानों में 23 जी सुइयों का उपयोग पिन, द्वितीय) पूर्वकाल त्वचा के नाक पर खींच लिया और टिकी है, मैं) रीढ़ की हड्डी तीन) / घेघा ट्रेकिआ दूर टिकी होना चाहिए गर्दन के आधार से.
  5. दो एससीजी मन्या धमनी द्विभाजन (भ्रूण प्रति दो SCGs है) के दोनों तरफ तैनात * के लिए देखो. एससीजी शाखा के नीचे स्थित है. द्विभाजन अलग खींच द्वारा एससीजी धमनियों से अलग करें. L15 मीडिया बर्फ पर 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में (0.4% डी (+) - ग्लूकोज के साथ पूरक) के 12 मिलीलीटर में ganglia रखें.

* एससीजी अपारदर्शी, पीले वसा ऊतक कि चारों ओर द्विभाजन की तुलना में पारदर्शी और रंगहीन है. अवशिष्ट वसा ऊतक और रक्त वाहिकाओं के रूप में ज्यादा ganglia इकट्ठा करने से पहले, हटाने की कोशिश करो.

  1. 1.4 और 1.5 दोहराएँ जब तक सभी SCGs भ्रूण से काटा जाता है.
  2. धीरे से 1 मिनट के लिए 600 rpm पर ganglia और अपकेंद्रित्र अतिरिक्त मीडिया महाप्राण (व्यंजन).
  3. L15 - युक्त मीडिया (0.25%, EDTA के बिना) trypsin और Collagenase (1 मिलीग्राम / एमएल) की 1 मिलीग्राम में ganglia Resuspend के. 37 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस, हर 10 मिनट के आंदोलन.
  4. Trypsin और 600 rpm पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र निष्क्रिय सी मीडिया (1x सदस्य, 0.4% डी () ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, 10% FBS) के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. के रूप में संभव के रूप में * / trypsin Collagenase मीडिया में ज्यादा से निकालें और 10ml के साथ सी - मीडिया के ganglia धो. 600 rpm पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. एक बार इस चरण को दोहराएँ.

* अवशिष्ट Collagenase interfe जाएगाकोलेजन संस्कृति की थाली पर सेल लगाव के लिए आवश्यक सब्सट्रेट के साथ कर रहे हैं.

  1. धोने मीडिया निकालें और फिर से निलंबित सी मीडिया के 1 मिलीग्राम में ganglia और 21 जी 5 मिलीलीटर सिरिंज कोशिकाओं * के बड़े clumps को अलग कर देना करने के लिए संलग्न सुई का उपयोग महीन चुर्ण बनाना. 23 जी सुई के साथ triturating तक दिखाई clumps को अलग कर रहे हैं समाप्त.

* नहीं से अधिक महीन चुर्ण बनाना सावधान रहो, के रूप में यह कोशिकाओं को नुकसान होगा. यदि trypsin और Collagenase इलाज सफल रहा था, पंद्रह वर्ष की एक अधिकतम ऊपर और नीचे 21 जी सुई के साथ चक्र, और 23 जी सुई के साथ तीन चक्रों के लिए पर्याप्त होना चाहिए.

  1. एक 70 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर [बी.डी. बायोसाइंसेज सेल छलनी] के माध्यम से अलग न्यूरॉन्स फ़िल्टर एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए किसी भी शेष clumps को त्यागने में.
  2. फ़िल्टर सेल निलंबन और trypan नीले रंग के साथ मिश्रण करने के लिए जीवित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित की 10 μl अशेष भाजक वापस ले लें. कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से निकालें की संख्या गिनतीUde डाई hemocytometer का उपयोग कर.
  3. 96 अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस (1.2 कदम देखें) इनक्यूबेटर में इंतज़ार कर बर्तन से laminin समाधान निकालें. पकवान सूखी नहीं, चढ़ाना कोशिकाओं के लिए तुरंत इस्तेमाल कर सकते हैं एक बार laminin निकाल दिया जाता है. - * 5,000-6,000 कुल जीवित कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 100 μl 50) कोलेजन और laminin पूर्व लेपित 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति डिश में बांटना. 50 एनजी / मिलीलीटर तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के सी - मीडिया में शामिल हैं.

यह अच्छा बाँझ टिशू कल्चर तकनीक को रोजगार महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं के विकास मीडिया से छोड़े गए हैं. इसके अलावा, वहाँ अलग अलग आपूर्तिकर्ताओं से sourced कोलेजन के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता हो सकता है. हम में Millipore से चूहे की पूंछ कोलेजन का उपयोग बैचों भर में लगातार परिणाम पड़ा है.

  1. DIV (इन विट्रो में दिन) में 1, सी - 50 μl NBM (0.4% डी (+) के साथ कोशिकाओं थाली करने के लिए प्रयोग किया जाता मीडिया की जगह - ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, बी 27 50 एनजी / मिलीलीटर NGF वाले पूरक, 5माइक्रोन aphidicolin और 20 माइक्रोन 5 fluorouracil [5 फ्लोरो - 2'- deoxyuridine]. संस्कृतियों * 5 दिनों के लिए सेते हैं. इस बिंदु पर, trypsinizing और कई कुओं में शेष कोशिकाओं गिनती एजेंट विरोधी mitotic उपचार जीवित न्यूरॉन्स की संख्या निर्धारित कर सकते हैं. आमतौर पर, लगभग 1000 न्यूरॉन्स एक साथ 96 प्लेट में अच्छी तरह से प्रति रहते हैं.

कवक या जीवाणु संक्रमण के साथ * समस्याएं आमतौर पर संस्कृति के पहले 24 घंटे के भीतर स्पष्ट कर रहे हैं. प्रत्येक अच्छी तरह से सावधानी से जांच चढ़ाना मीडिया की जगह से पहले माइक्रोबियल विकास के लिए. यदि कुओं का केवल एक सीमित संख्या को प्रभावित कर रहे हैं, वे एक कमजोर ब्लीच समाधान, पीबीएस के साथ rinsed और आदेश में प्रयोग के साथ आगे बढ़ना सूखे के साथ इलाज किया जा सकता है. हम जहां भी कुओं की एक सीमित संख्या में माइक्रोबियल संदूषण था किसी भी प्रयोग दोहराने की सलाह देते हैं. यदि व्यापक माइक्रोबियल संदूषण के साथ 96 पकवान में मनाया जाता है, प्रयोग समाप्त किया जाना चाहिए.

2. एससीजी पंथ का संक्रमणएचएसवी -1 Us11 EGFP और विलंबता की स्थापना के साथ ures

Virological तकनीक, बुनियादी प्रचार वायरस, वायरस टिटर का निर्धारण, और संक्रमण की बहुलता (MOI), सहित पर उपयोगी पृष्ठभूमि के लिए, पाठक से 5 संदर्भ में संदर्भित किया जाता है. Herpesvirus जीव विज्ञान की एक चर्चा के लिए, पाठक से 6 संदर्भ में संदर्भित किया जाता है. अंत में, पाठक पूर्व उदाहरणों, अन्य प्रोटोकॉल, और अतिरिक्त पृष्ठभूमि अल्फा herpesvirus एससीजी न्यूरॉन्स की lytic संक्रमण के बारे में के लिए और हमारे प्रोटोकॉल के लिए विलंबता और पुनर्सक्रियन अध्ययन के रूपांतरों के साथ तुलना के लिए 7-10 संदर्भ के लिए भेजा है.

  1. 6 DIV पर, प्रत्येक अच्छी तरह * में मौजूदा मीडिया के लिए acyclovir (ACV), अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन जोड़ें. उदाहरण के लिए, अगर हर अच्छी तरह से 50 μl शामिल हैं, एक 300 माइक्रोन ACV स्टॉक के 25 μl जोड़ें. आमतौर पर, ACV संक्रमण से पहले की रात को जोड़ा जाता है, लेकिन यह भी संक्रमण के 6-8 पूर्व घंटा जोड़ा जा सकता है.

* यह पूर्व हैceedingly सभी समय न्यूरॉन के अनावश्यक शारीरिक गड़बड़ी को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. बस हटाने और मीडिया की जगह या वायरस शेयरों के साथ संक्रमण बहुत धीरे और धीरे से किया जाना चाहिए. अन्यथा, जिसके परिणामस्वरूप यांत्रिक तनाव न्यूरॉन व्यवहार्यता पर प्रतिकूल असर कर सकते हैं.

  1. 7 DIV में संक्रमण की बहुलता (MOI), -2 1 के बीच (इष्टतम MOI का निर्धारण करने पर महत्वपूर्ण टिप्पणी नीचे देखें) पर एचएसवी 1 Us11-EGFP (11 रेफरी में वर्णित) के साथ एससीजी संस्कृतियों को संक्रमित. सीधे अच्छी तरह से में मौजूदा मीडिया पतला वायरस जोड़ें. संक्रमित नियंत्रण नकली और ACV कमी मीडिया में lytic संक्रमण सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं. संक्रमण 2-3 घंटे के लिए 37 पर आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस

* MOI के वायरस टिटर वेरो 12 कोशिकाओं और मढ़वाया, जीना 1.14 चरण में अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में एक पट्टिका परख प्रदर्शन से निर्धारित का उपयोग कर की गणना है. इस गणना एक संचालन भावना में केवल उपयोगी है,सेल की कुल संख्या के रूप में वरीयता प्राप्त न्यूरॉन्स एक साथ शामिल हैं contaminating के glia, और fibroblasts साथ. के रूप में इन contaminating के कोशिकाओं को विभाजित विरोधी mitotic एजेंट के साथ इलाज के द्वारा मारे गए हैं, MOI के जीवित न्यूरॉन्स के लिए प्रभावी वास्तव में अधिक से अधिक है. 5000 के प्रारंभिक शुरू मात्रा से 6000 जीवित कोशिकाओं, विरोधी mitotic एजेंट को (के रूप में trypsinizing और प्रत्यक्ष सेल गिनती द्वारा मूल्यांकन) के साथ इलाज के बाद लगभग 1000 न्यूरॉन्स रहते हैं. MOI के इष्टतम उपयोग करने के लिए जब neuronal संस्कृतियों का संक्रमण एक वायरस स्टॉक तैयारी से अगले करने के लिए कुछ भिन्न हो सकते हैं. वायरस की हर नई तैयारी के साथ, हम अलग MOI के 1 से 2 के एक सीमित रेंज परीक्षण की सलाह देते हैं. यहाँ लक्ष्य के लिए एक कि न्यूरॉन व्यवहार्यता और inducible पुनर्सक्रियन घटनाओं (धारा 3 में परिभाषित) की सबसे बड़ी संख्या में परिणाम पर कम से कम प्रभाव है की पहचान है. वायरस Us11-EGFP विशेष रूप से तेजी से परिस्थितियों को अनुकूलित करने में सहायक है, लेकिन एक भी ऐसे पट्टिका परख या quanti के रूप में अन्य readouts में उपयोग कर सकते हैंगुणात्मक पीसीआर. यह एक sucrose के तकिया के माध्यम से शुद्ध करने के लिए दोष है कि सेल व्यवहार्यता को कम करने को दूर करने के लिए, यद्यपि यह आवश्यक है और नियमित प्रदर्शन नहीं नहीं है वायरस का उपयोग करने के लिए मदद कर सकते हैं.

  1. ध्यान से ताजा NBM 50 एनजी / NGF मिलीलीटर और 100 माइक्रोन ACV * युक्त के साथ संक्रमण मीडिया की जगह.

* यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है बेहद कोमल हो जब संक्रमण मीडिया बदल रहा है. अच्छी तरह से दीवार के बजाय अच्छी तरह से नीचे विंदुक की टिप उद्देश्य, और मीडिया धीरे कोशिकाओं पर नीचे स्लाइड करने की अनुमति देते हैं. विंदुक से मीडिया का भी तेजी से इंजेक्शन सब्सट्रेट से axons और कोशिकाओं से स्लाव कोशिकाओं के एक पत्रक के रूप में आम तौर पर अलग कारण के लिए पर्याप्त बल उत्पन्न कर सकते हैं. न्यूरॉन्स नये (20-30%) केवल एक सीमित संख्या यदि परिणाम है कि कोशिकाओं को स्वस्थ दिखाई देते हैं कम कर रहे हैं. अलग न्यूरॉन्स समय पर पुनः अनुलग्न की संभावना है, तथापि, axons नहीं रह अच्छी तरह से एक होगा बढ़ाया जाघ नए axons regrow करने होंगे. नहीं इष्टतम हालांकि, प्रयोग अगर कुओं का केवल एक सीमित संख्या को प्रभावित कर रहे हैं आगे बढ़ सकते हैं. अगर वहाँ न्यूरॉन्स की व्यापक टुकड़ी (70-80%) है, हम प्रभावित प्रयोग में अच्छी तरह से () शामिल नहीं की सिफारिश करते हैं. यदि कुओं के बहुमत 70-80% अलग न्यूरॉन्स होते हैं, हम प्रयोग समाप्त करने की सिफारिश जबकि न्यूरॉन्स अभी भी पुनः अनुलग्न हो सकता है., वे आम तौर पर बड़े clumps फार्म का होगा. यह व्यक्ति पुन: सक्रिय न्यूरॉन्स की उचित मूल्यांकन पेचीदा. हम किसी भी प्रयोग में जहां अलग न्यूरॉन्स के साथ कुओं करने के लिए सुनिश्चित करें कि पुनर्सक्रियन दर कुओं न्यूरॉन्स के अंतर पालन द्वारा प्रभावित नहीं थे मनाया गया दोहरा करने की सलाह देते हैं.

इसके अलावा, यह हमेशा धीरे के रूप में संभवतः के रूप में संस्कृतियों को संभालने के लिए महत्वपूर्ण है. अनावश्यक, अचानक आंदोलनों (दोहराया खोलने सहित और एक मशीन कक्ष के दरवाजे के बंद) या सशक्त मीडिया आवेदन ग से यांत्रिक तनावould समझौता संस्कृतियों एचएसवी 1 विलंबता का समर्थन करने के लिए, संभवतः एक भी प्रयोग में सहज पुनर्सक्रियन के unacceptably उच्च दरों में जिसके परिणामस्वरूप करने की क्षमता.

  1. 6 दिन जो समय के दौरान वायरस विलंबता की स्थापना के लिए संस्कृतियों बनाए रखें. इस अवधि के दौरान, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन उपयोग lytic प्रतिकृति की एक संकेतक के रूप में न्यूरॉन स्वास्थ्य और Us11 EGFP अभिव्यक्ति की निगरानी है. Us11-EGFP नियंत्रण ACV उपचार कमी कुओं में केवल पता लगाया जाना चाहिए, सफल प्राथमिक संक्रमण और उत्पादक lytic प्रतिकृति का संकेत है. न्यूरॉन्स भी उत्पादक वायरल विकास के अभाव में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव दिखा सकते हैं. संक्रमित संस्कृतियों को बारीकी से निगरानी करनी चाहिए और नकली संक्रमित न्यूरॉन्स की तुलना में.

3. पुनर्सक्रियन और आकलन

  1. 14 DIV में, ध्यान से ताजा ACV कमी मीडिया के साथ ACV युक्त मीडिया की जगह. यदि उपयुक्त हो, इस समय में औषधीय चर (या जैविक) शामिल हैं. होना है2.3 में कहा गया है सावधानियों का पालन ure.
  2. 5 से 6 दिन की अवधि के दौरान, जीना संस्कृतियों एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग पुनर्सक्रियन के दौर से गुजर न्यूरॉन्स का पता लगाने की निगरानी. वैकल्पिक रूप से विश्लेषण के अन्य प्रकार (प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, पट्टिका परख आदि) के लिए नमूने इकट्ठा.
  3. EGFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स युक्त कुओं की संख्या की गणना के द्वारा पुनर्सक्रियन आवृत्ति गणना और नमूना कुओं की कुल संख्या के अनुपात के रूप में यह व्यक्त है. ध्यान दें कि EGFP अभिव्यक्ति में एक व्यक्ति को अच्छी तरह से एक प्राथमिक पुनर्सक्रियन घटना और बाद में वायरल प्रसार के कारण संक्रमण के बीच भेद नहीं करता. संक्रामक प्रसार के बाद से एक ही संस्कृति को अच्छी तरह से निहित है, एक अच्छी तरह से में एक या एक से अधिक EGFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स सक्रिय इन शर्तों के तहत एक पुनर्सक्रियन घटना के रूप में परिभाषित है.

* एकाधिक पुनर्सक्रियन घटनाओं संस्कृति में होते हैं, 1 में वर्णित के रूप में कर सकते हैं. वायरल प्रसार से एक प्राथमिक पुनर्सक्रियन घटना reac से उत्पन्न भेद tivation, encapsidation अवरोध करनेवाला तरह 150,138 जोड़ा जा सकता है. Encapsidation अवरुद्ध करके, संक्रामक वायरस और उत्पादन नहीं पुनर्सक्रियन से परिणामस्वरूप फैल संभव नहीं है. इस प्रकार, EGFP तरह 150,138 की उपस्थिति में पता चला संकेत एक झुलसाना 1,13-15 अच्छी तरह से संस्कृति के भीतर स्वतंत्र पुनर्सक्रियन की घटनाओं की संख्या को दर्शाता है. ध्यान दें कि तरह 150,138 एचएसवी -1 पैटन तनाव के खिलाफ प्रभावी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है. तरह 150,138 के लिए एक विकल्प के रूप में, निम्न में से किसी एक का उपयोग पर विचार करें: मैं) अपने पड़ोसी की कोशिकाओं में फैल करने की क्षमता में एक उत्परिवर्ती बिगड़ा वायरस का उपयोग किया जा सकता है, ii) एक पत्रकार के वायरस जहां EGFP एक आईई प्रमोटर से निरंतर उपस्थिति में व्यक्त किया है Paa या ACV साथ में उपचार iii) immunofluorescence का उपयोग करने के लिए एक IE जीन उत्पाद के खिलाफ एंटीबॉडी के बाद देर से जीन अभिव्यक्ति (और संक्रामक वायरस उत्पादन) को रोकने, ACV की.

4. वैकल्पिक परख का उपयोग पुनर्सक्रियण आकलन तरीके

"ontent एक व्यक्ति, एकल प्रयोग से परिणाम एससीजी की भी तैयारी से प्राप्त किया जाना चाहिए दोहराएँ प्रयोगों में लंबे समय के रूप में स्वतंत्र एससीजी की तैयारी के साथ किया जा सकता है प्रत्येक को दोहराने के रूप में एक एकल एससीजी बैच का उपयोग कर आयोजित किया गया.

  1. एचएसवी -1 lytic टेप के मूल्यांकन. पुनर्सक्रियन की विभिन्न प्रयोगात्मक inducers की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ACV हटाने के बाद वांछित समय शाही सेना लीजिए. 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट का उपयोग कर, हम कम से कम 20 कुओं प्रत्येक नमूने के लिए एक साथ (आरएनए नमूना प्रति लगभग 10 5 कोशिकाओं) पूलिंग की सलाह देते हैं. वैकल्पिक रूप से, SCGs बड़े कुओं में चढ़ाया जा सकता है (जैसे एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए, 4-5 x10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से उपयोग). हालांकि यह निश्चित रूप से संभव है कम से कम 20 कुओं, छोटे संस्करणों अनुचित नमूना नमूना परिवर्तनशीलता में शामिल परिणाम से शाही सेना का पता लगाने के लिए.
  2. एचएसवी -1 lytic प्रोटीन का पता लगाने. पुनर्सक्रियन के शामिल होने के बाद एक वांछित समय पर lysates लीजिए. Lysis बफर के 7.5 μl 10 w के प्रत्येक के लिए जोड़ेंएक 96 अच्छी तरह से थाली में ells और एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting के द्वारा विश्लेषण. वैकल्पिक रूप से, वायरल प्रोटीन अप्रत्यक्ष immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है. प्रारंभिक चढ़ाना एक बाँझ कांच coverslip है कि पूर्व में लिपटे पाली - डी - lysine - (0.2 मिलीग्राम / एमएल, सिग्मा) के साथ किया गया है कोलेजन और laminin के आवेदन से पहले के रूप में इमेजिंग के लिए एक mountable सब्सट्रेट पर किया जाना चाहिए (1.10 देखना) .
  3. संक्रामक कणों की जांच. इस पुनर्सक्रियन पर संस्कृति सतह पर तैरनेवाला लीजिए. वेरो कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला के धारावाहिक dilutions के उपयोग monolayers पर एक पट्टिका परख प्रदर्शन करते हैं. इसके अतिरिक्त, पट्टिका assays के फ्रीज, thawed संस्कृतियों के lysates का उपयोग करने के लिए सेल से जुड़े कणों को शामिल करने के लिए अनुमापांक निर्धारित किया जा सकता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2A एक उदाहरण है, जहां 1 माइक्रोन trichostatin के (TSA) के 16-18 पुनर्सक्रियन का एक ज्ञात inducer के जंगली प्रकार एच के साथ गुप्त रूप से संक्रमित संस्कृतियों एससीजी के लिए लागू किया जाता है दिखाता हैSV1 संवाददाता EGFP-Us11 तनाव के. TSA के साथ, पुनर्सक्रियन 2 दिनों के भीतर अधिकतम 50% तक पहुँच जाता है, और कुओं का लगभग 60% में 5 पुनर्सक्रियन पठारों दिन के द्वारा. बेस लाइन पुनर्सक्रियन (स्वतःप्रवर्तित ') इस प्रयोग में लगभग 10% है और आम तौर पर 10-20% इन विट्रो प्रणाली में इस का उपयोग कर से पर्वतमाला. अधिकतम पुनर्सक्रियन का स्तर जो पुनर्सक्रियन inducer के उपयोग किया जाता है के आधार पर बदलती हैं. कई पुनर्सक्रियन inducers प्रयोग की अवधि के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में वे उत्पादक वायरल प्रतिकृति के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं, लेकिन इस अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. किसी भी अभिकर्मक है कि न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है या वायरल उत्पादक जीवन चक्र के पूरा होने के hinders है सहित अन्य inducers, एक क्षणिक नाड़ी आवेदन पुनर्सक्रियन भड़काने के लिए आवश्यकता हो सकती है.

जबकि चित्रा 2A में चित्रित प्रयोग की हर अच्छी तरह से में EGFP-Us11 के संचय विलंबता से पुनर्सक्रियन का संकेत है, यह भेद नहीं पड़ता किUs11-EGFP व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में संकेत एक स्वतंत्र पुनर्सक्रियन घटना है, या संस्कृति के माध्यम से पुन: सक्रिय एक वायरस के प्रसार से ली गई है. प्रत्येक अच्छी तरह से स्वतंत्र पुनर्सक्रियन घटनाओं के दौर से गुजर न्यूरॉन्स की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए, संस्कृतियों गया पूर्व रास्ता 150,138, एक यौगिक है कि विशेष रूप से वायरल डीएनए 13-15 जीनोम की encapsidation को रोकने के द्वारा वायरल प्रसार ब्लॉक के साथ इलाज किया. संक्रमित सहानुभूति न्यूरॉन संस्कृतियों रास्ता - 150,138 और TSA साथ प्रेरित पुनर्सक्रियन के साथ इलाज किया गया. EGFP सकारात्मक न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या के ही टीएसए इलाज कुओं में पाया गया, DMSO के इलाज नियंत्रण संस्कृतियों की तुलना में, प्रदर्शन कि स्वतंत्र पुनर्सक्रियन की घटनाओं की संख्या अलग - अलग संस्कृति के प्रति होते हैं (चित्रा 2B).

हमारे परख, संवाददाता Us11 EGFP के अंतर्जात Us11 11 प्रमोटर से व्यक्त किया है. चूंकि Us11 "सच देर" या है γ 2 वायरल lytic जीन, वायरल डीएनए प्रतिकृति मजबूत expressi के लिए आवश्यक हैपर. यह 3 चित्र में सचित्र है, के रूप में EGFP-Us11 संचय के PI3-kinase अवरोध करनेवाला LY294002 के साथ पुन: सक्रिय करने के लिए प्रेरित संस्कृतियों में वायरल डीएनए पोलीमरेज़ अवरोध करनेवाला phosphonoacetic एसिड (पा) से प्रभावित है.

चित्रा 1
आकृति 1. योजनाबद्ध एक ठेठ प्रयोगात्मक इन विट्रो प्रणाली में सुसंस्कृत न्यूरॉन का उपयोग करने के लिए एचएसवी -1 विलंबता और पुनर्सक्रियन का अध्ययन प्रोटोकॉल illustrating के 1.) E21 चूहों से बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) विदारक करने के बाद, अलग न्यूरॉन्स 96 अच्छी तरह से बर्तन में चढ़ाया जाता है और विरोधी mitotic के साथ इलाज एजेंटों गैर neuronal कोशिकाओं को दूर करने के लिए. 2) इन विट्रो (DIV) में 6 दिनों के बाद पुनः संयोजक एचएसवी -1 जिसमें उपस्थिति (ACV) acyclovir, एक antiviral दवा में वायरस इनकोडिंग Us11 देर जीन (EGFP एचएसवी 1) के लिए जुड़े हुए EGFP संस्कृतियों से संक्रमित होते हैं कि lytic प्रतिकृति ब्लॉक. 3) 14 दिन तक (14 DIV) acyclovir हटा दिया है और EGFP अभिव्यक्तिपता नहीं है. संस्कृतियों stably 1 महीने या उससे अधिक के लिए किया जा सकता है इस तरह से बनाए रखा, या एक परीक्षण चर विलंबता से पुनर्सक्रियन भड़काने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए जोड़ा जा सकता है. चर एक छोटा सा अणु रासायनिक अवरोध करनेवाला, एक घुलनशील neurotrophin या कोशिका की सतह प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी या एक lentivirus के रूप में या तो एक shRNA जीन के विशिष्ट या एक ectopically व्यक्त प्रोटीन व्यक्त किया जा सकता है. पुनर्सक्रियण तो वास्तविक समय में EGFP सकारात्मक कुओं स्कोरिंग द्वारा नजर रखी है.

चित्रा 2
चित्रा 2. TSA एससीजी संस्कृतियों में एचएसवी -1 reactivates एससीजी संस्कृतियों गुप्त रूप से चित्र 1 में वर्णित के रूप में संक्रमित थे. 14 DIV में ACV हटा दिया गया था और जगह मीडिया 1 माइक्रोन trichostatin के युक्त के साथ एक (TSA) के. (ए) संस्कृतियों कल्पना और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रत्येक दिन 5 दिनों की अवधि के लिए दवा उपचार के बाद स्कोर. reactivat के दौर से गुजर कुओं का प्रतिशतप्रयोग के पाठ्यक्रम पर आयन DMSO के नियंत्रण का इलाज संस्कृतियों की तुलना में दिखाया गया है. पुनर्सक्रियन का प्रतिशत एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के 20 कुओं के बाहर EGFP सकारात्मक कुओं की संख्या के द्वारा की गणना की गई. त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का संकेत मिलता है. (बी) के गुप्त रूप से संक्रमित संस्कृतियों TSA और वायरल डीएनए encapsidation के एक अवरोध करनेवाला, जिस तरह से 150,138 (20 / μg मिलीलीटर) के साथ इलाज किया गया. EGFP + न्यूरॉन्स की संख्या नियंत्रण DMSO और तरह 150,138 साथ इलाज के लिए दवाओं के साथ इलाज के बाद 48 घंटे की तुलना में किया गया था. प्रत्येक डेटा बिंदु EGFP एक संस्कृति में 1,000 न्यूरॉन्स की अच्छी तरह से बाहर न्यूरॉन्स के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है. बार पता चलता है EGFP का औसत प्रतिशत + न्यूरॉन्स में एक अच्छी तरह से.

चित्रा 3
चित्रा 3. EGFP detecion वायरल डीएनए प्रतिकृति पर निर्भर है एससीजी संस्कृतियों. गुप्त रूप से तो LY29004, 1 पुनर्सक्रियन का एक ज्ञात inducer के 10 माइक्रोन के साथ इलाज किया गया संक्रमित. LY वा (नीला) द्वारा प्रेरित पुनर्सक्रियणहै वायरल डीएनए संश्लेषण अवरोध करनेवाला, phophonoacetic एसिड, Paa (300μg/ml, लाल) और दोनों एक साथ यौगिकों (हरा) के साथ इलाज किया उन लोगों की तुलना में.

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Discussion

यह प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति और संक्रमण प्रणाली आणविक एचएसवी -1 विलंबता और पुनर्सक्रियन अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए एक सरल और प्रभावी करने के लिए विधि प्रदान करता है. प्रणाली ईमानदारी से विलंबता के स्वीकार किए जाते हैं दोनों मानव संक्रमण में और जीवित पशु मॉडल में परिभाषित पहचान का स्मरण दिलाता है. जब वायरस एससीजी संस्कृतियों में अव्यक्त है, संक्रामक कणों और वायरल lytic जीन उत्पादों का पता लगाया नहीं जा सकता. गुप्त रूप से संक्रमित न्यूरॉन्स में केवल वायरल जीन का पता चला उत्पाद गैर कोडन अक्षां प्रतिलिपि, जो नाभिक के भीतर जमा है. पुनर्सक्रियण वायरल lytic जीन की अभिव्यक्ति के साथ मेल खाता है और संक्रामक कणों के उत्पादन में खत्म. इसके अलावा, इस प्राथमिक न्यूरॉन सेल संस्कृति मॉडल टीएसए, जो प्रभावी रूप से lytic वायरल प्रतिकृति लाती के रूप में स्वीकार किए जाते हैं पुनर्सक्रियन inducers के लिए उत्तरदायी है.

विभिन्न रासायनिक inducers अलग विस्तार के पुनर्सक्रियन को प्रोत्साहित और विशेषता कैनेटीक्स के साथ. उदाहरण के लिए, टीएसए reproducibly एक 5 प्रेक्षण अवधि से अधिक संस्कृतियों का 60-70% में पुनर्सक्रियन लाती है. TSA प्रेरित पुनर्सक्रियन की समान स्तर पर गुप्त रूप से संक्रमित, विभेदित चूहा PC12 कोशिकाओं को 17 या 18 murine त्रिपृष्ठी न्यूरॉन संस्कृतियों फियोक्रोमोसाइटोमा का उपयोग कर सूचित किया गया है. पुनर्सक्रियन के कैनेटीक्स हम पालन और संस्कृतियों के 100% को पुन: सक्रिय करने के लिए TSA की अक्षमता को अव्यक्त derepressed जा जीनोम की क्षमता में विविधता है को प्रतिबिंबित सकता है. इस प्रस्ताव के साथ संगत है, TSA प्रेरित पुनर्सक्रियन की प्रभावकारिता कथित तौर पर 18 संस्कृति में समय के एक समारोह के रूप में कम हो जाती है. TSA के विपरीत में, LY29004 2-3 घ के भीतर संस्कृतियों की 80-90% में पुनर्सक्रियन लाती है. विलंबता की स्थापना या MOI में अंतर inducible पुनर्सक्रियन में TSA और LY29004 के बीच मतभेद के लिए खाते के रूप में विलंबता की स्थापना के लिए हमारी शर्तों reproducibly न्यूरॉन्स कि वायरस इनकोडिंग विलंबता गधा व्यक्त की लगभग 20% में परिणाम की संभावना नहीं हैंociated प्रतिलिपि अक्षां 1. हालांकि, हम अभी तक वायरल जीनोम पॉजिटिव कोशिकाओं के अंश नहीं मापा है, संभावना है कि LY29004 टीएसए से न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या में पुनर्सक्रियन लाती है स्थापना. जबकि अंतर क्षमता TSA और LY20004 के अंतर्निहित कारणों पुनर्सक्रियन प्रेरित करने के लिए निर्धारित किया है, यह स्पष्ट है कि विभिन्न उत्प्रेरण एजेंट विशेषता क्षमता और कैनेटीक्स के साथ पुनर्सक्रियन को बढ़ावा कर सकते हैं.

प्रणाली का एक शक्तिशाली पहलू जंगली प्रकार के वायरस या रिपोर्टर उपभेदों कि एक जंगली प्रकार के वायरस से अपरिज्ञेयता व्यवहार का उपयोग करने की क्षमता है. पहले सेल संस्कृति एचएसवी 1 विलंबता है, जो उत्परिवर्ती एचएसवी वेरिएंट कि उत्पादकता 16,18,19, 20 में समीक्षा दोहराने में असमर्थ थे पर भरोसा अध्ययन प्रणालियों के विपरीत, हमारे मॉडल प्रणाली तनाव EGFP रिपोर्टर है कि जंगली प्रकार से अप्रभेद्य है शामिल है सुसंस्कृत 11 कोशिकाओं में lytic प्रतिकृति दक्षता के मामले में वायरस. एक EGFP संवाददाता वी के उपयोगirus विलंबता और पुनर्सक्रियन की एक संवेदनशील और सरल दृश्य के आकलन के लिए अनुमति देता है. Β-galactosidase, जो निर्धारण और विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के सेल की आवश्यकता के रूप में अन्य पत्रकारों के विपरीत है, EGFP शोधकर्ता एक प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम में वायरल राज्य की निगरानी करने की अनुमति देता है, एक आसान, वास्तविक समय का आकलन प्रदान सहज और प्रेरित पुनर्सक्रियन. अन्य विधियों, मात्रात्मक पीसीआर की तरह, भी वायरल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न है कि EGFP अभिव्यक्ति पूर्व में होना है, के बाद से EGFP एक "सच देर से जीन, वायरस उपभेदों कि एक पत्रकार जीन की कमी के लिए या के रूप में व्यक्त किया है को देखने के लिए उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, जहां EGFP (आईई) तत्काल जल्दी या जल्दी जीन (ई) से जुड़े हुए है अन्य रिपोर्टर वायरस विकसित किया जा सकता है. "सच देर वर्णित EGFP संवाददाता का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि EGFP अभिव्यक्ति इसरो वायरल डीएनए संश्लेषण पर निर्भर है, यह दर्शाता है कि वायरस जीवन चक्र अंतिम lytic वृद्धि के साथ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति चरण में रवाना किया है. इंडस्ट्रीज़eed, "सच देर EGFP दृश्य निरीक्षण द्वारा detectable स्तर अभिव्यक्ति संक्रामक वायरस उत्पादन, एक जैविक सूचक के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है कि उत्पादक पुनर्सक्रियन हुआ है. हालांकि, यह देखा जा करने के लिए अगर प्रत्येक न्यूरॉन है कि पुनर्सक्रियन शुरू, के रूप में उत्पादक (lytic) चक्र जीन की अभिव्यक्ति के द्वारा मापा, पूरा lytic संक्रामक वायरस का उत्पादन कार्यक्रम के माध्यम से प्रगति करने में सक्षम है रहता है. शायद वायरस को निरस्त करने के लिए पर्याप्त अवसर lytic कार्यक्रम है और विलंबता पैर जमाने. इस प्रकार, संवाददाता आईई या ई प्रोटीन के लिए जुड़े हुए EGFP व्यक्त वायरस कम विश्वसनीय पुनर्सक्रियन readouts में हो सकता है. इस दृष्टिकोण से, पुनर्सक्रियन की क्षमता EGFP-संवाददाताओं से IE, ई, या देर से प्रमोटरों, या भी अलग फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रत्येक गतिज वर्ग से एक जीन उत्पाद के लिए जुड़े हुए प्रोटीन के साथ एक संयुक्त संवाददाता से व्यक्त की तुलना का उपयोग करके मापा (आईई बनाम बनाम ई देर से) उपयोगी होगा. इसके अलावा, हमारे neuronal सेल संस्कृति प्रणाली भी अलग सेंट एचएसवी -1 के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैबारिश, उनके neuroinvasive संभावित या मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 21-24 को नियंत्रित करने की क्षमता की परवाह किए बिना. अंत में, इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में यहाँ वर्णित अन्य neuronal सेल प्रकार और पूर्व vivo परिधीय ganglia संस्कृतियों के मनुष्य 25-27 सहित उच्च आदेश प्रजातियों से प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है.

न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी का उपयोग करके, आणविक स्तर पर HSV1 और अपने neuronal मेजबान के बीच बातचीत का विस्तृत अध्ययन अब संभव है. गौरतलब है कि, इस मॉडल प्रणाली के कई जटिल अध्ययन विलंबता और असुरक्षित पशुओं में पुनर्सक्रियन, जहां नियंत्रण के अतिरिक्त स्तर मौलिक वायरस न्यूरॉन बातचीत के शीर्ष पर स्तरित हैं के साथ जुड़े मुद्दों से बचा जाता है. इसके अलावा, इस सिस्टम में काम स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि वहाँ वास्तव में वायरस और मेजबान है कि और स्थापित किया जा सकता है और एक अधिग्रहीत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से सहायता के बिना बनाए रखा न्यूरॉन के बीच एक स्थिर रिश्ता है. हालांकि सहज और adaptivई प्रतिरक्षा स्पष्ट रूप से अव्यक्त एचएसवी संक्रमण के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, वायरस आंतरिक क्षमता मैं) एक गैर उत्पादक न्यूरॉन्स में विलंबता जैसी संक्रमण की स्थापना है, और ii) पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया में lytic, उत्पादक प्रतिकृति कार्यक्रम के लिए स्विच और neuronal संकेत अकेले न्यूरॉन्स के लिए लागू होता है. महत्वपूर्ण बात है, अब एचएसवी और न्यूरॉन के बीच इस अनूठे रिश्ते के लिए आणविक आधार सेल जैविक, औषधीय, जीन मुंह बंद करने, और जीन डिलीवरी उपकरण 1 का उपयोग dissected किया जा सकता है. इस तरह के अध्ययन है कि न्यूरॉन और अलगाव में वायरस पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं जहां कई सेल प्रकार ganglial डिब्बे पर कब्जा पशु मॉडल में संभव नहीं हैं. हमें उम्मीद है कि इस मॉडल प्रणाली का उपयोग करके, जटिल आण्विक circuitry के लिए एक व्यापक समझ एचएसवी -1 न्यूरॉन्स में विलंबता के विनियमन के अंत में हासिल किया जा सकता है. जब भी संभव हो, इस सुसंस्कृत न्यूरॉन सिस्टम से gleaned सिद्धांतों तो स्थापित पशु मो का उपयोग vivo में परीक्षण किया जा सकता हैdels, एचएसवी -1 विलंबता की समग्र अध्ययन के लिए इन दो दृष्टिकोणों के पूरक प्रकृति illustrating है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम अपने विचारशील सुझाव है कि इस पांडुलिपि में सुधार करने में मदद के लिए समीक्षकों धन्यवाद. यह काम (HD23315 NS21072,) MVC, ACW (S10RR017970, GM61139) के के और आईएम (GM056927, AI073898) NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. एम के हिस्से में एक NIH प्रशिक्षण अनुदान (AI007180 5T32) के द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

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References

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

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इम्यूनोलॉजी 62 अंक न्यूरॉन सेल संस्कृति दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) आणविक जीव विज्ञान विषाणु विज्ञान
हरपीज के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति सिस्टम वायरस लेटेंसी और पुनर्सक्रियण सिंप्लेक्स
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