Summary
프로토콜은 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 대기 시간과 재활 성화를 단순 공부하는 효율적이고 재현성 모델 시스템을 설명합니다. 분석은 동질적인 교감 신경 세포 배양을 고용하고 RNA 간섭 및 재조합 단백질의 표현을 포함한 다양한 도구를 사용하여 바이러스 신경 세포 상호 작용의 분자 해부을 허용합니다.
Abstract
헤르페스는 타입 1 (HSV-1)은 말초 신경의 평생 잠재 감염을 수립 바이러스를 단순. 이것은 잠재 저장조는 전송을 보장하고 임상 질환에 기여하는 반복 재가입 이벤트의 소스입니다. 현재 antivirals는 잠재 저수지에 영향을주지 않으며 아무 백신은 없습니다. lytic 복제 분자 세부 사항이 잘 특성화 있지만, 뉴런에 지연 시간을 조절하는 메커니즘은 애매 남아있다. 대기 시간 우리의 현재 이해 바이러스성 유전자 요구 사항 및 면역 반응의 역할을 정의를 위해 불가 결한되어 작은 동물 모델을 이용한 생체내 연구에서에서 파생됩니다. 그러나, 그것은 살아있는 동물의 면역 또는 이외의 연결을 지원하는 세포에 의해 매개 감염의 더 일반적인 결과로부터 바이러스 신경 세포의 관계에 대한 구체적인 효과를 구별하는 것은 불가능합니다. 또한, 동물 실험은 호스트를 조작 위해 비용이 많이 드는 시간 소모와 사용 가능한 옵션 면에서 제한처리합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경 세포 전용 시스템은 필사적으로 지연 및 재가입의 생체내 특성에를 재현하지만, 균질성 및 접근성 측면에서 조직 문화의 혜택을 제공하는 필요합니다.
여기에 맞는 HSV-1 지연과 재활 성화를 공부 쥐 우수한 경추 신경 (SCG) (그림 1)에서 교양 기본 공감 뉴런을 이용한 체외 모델을 제시 대부분의 모든 원하는 조건의 경우. 이외의 연결을 세포를 제거하면 거의 균질 TrkA + 신경 세포 배양은 lytic 복제를 억제하는 아시 클로 비어의 존재 (ACV)에서 HSV-1에 감염됩니다. 아래 ACV 제거, 신실 대기의 인정 특징이 효율적으로 설립되어 전시 비생산적인 HSV-1 감염. 특히, lytic mRNAs, 단백질 및 전염성 바이러스도 선택의 부재에서 감지되고 있지만, 지연 - 관련 증명서 (LAT) 특급이온 핵의 연결에 지속. 바이러스성 genomes은 신경 세포 당 25의 평균 사본 번호로 유지하고 생산 PI3 - 키나 아제 / Akt 신호 또는 신경 성장 인자 1의 간단한 인출을 방해하여 복제에 시달릴 수 있습니다. 바이러스성 lytic 단백질 Us11로 융합된 재조합 HSV-1 인코딩 EGFP는 쉽게 계량되어 재가입으로 인한 복제 기능, 실시간 마커를 제공합니다. 화학 요법과 더불어, 그러한 lentiviral 벡터를 통해 RNA 간섭이나 유전자 전달과 같은 유전적인 방법론이 성공적으로 매우 어려운이 아니라면 불가능한, 동물에있는 기계론의 연구를 허용하는 시스템에 적용할 수 있습니다. 요약에서는 SCG 기반 HSV-1 대기 / 재가입 시스템은 뉴런의 HSV1 지연 및 재활 성화, 누구의 솔루션을 새로운 치료법을 개발에 신선한 통찰력을 제공할 수 있습니다 바이러스학의 오랜 퍼즐을 제어하는 분자 메커니즘을 해명하기위한 강력하고 필요한 도구를 제공합니다 대상 t그는 herpesvirus 탱크를 잠재.
Protocol
1. 쥐 태아에서 SCG 뉴런의 분리 및 문화
이 프로토콜을 이해하는 데 유용한 컨텍스트를 제공하고,하기 이전 문학의 광범위한 토론을위한 그 체외 배양, 플레이트 코팅 기판, 그리고 혈청 프리 미디어의 구성 요소에 SCG의 기초를 포함하여 SCG 신경 세포 문화의 설립 방법, 독자는 참고 문헌 2-4라고합니다.
- SCG 뉴런에 대한 소스로 쥐의 사용 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 활성 프로토콜 하에서 NIH 지침에 따라 실시되었다.
- 절개를 시작하기 전에 콜라겐과 코팅 laminin 96 잘 조직 문화 요리를 준비합니다. 다중 채널 pipetting 장치를 사용하여 0.66 MG / ML의 쥐의 꼬리 콜라겐을 포함하는 솔루션으로 모두 96 우물을 채울. 즉시 회수 및 최대 8 절개로 사용할 수 있습니다 콜라겐을 제거합니다. T를 제거 후그는 콜라겐, 그건 층류 후드 아래 우물 건조하게하는 것이 매우 중요합니다. 그것이 건조하는 데 걸리는 시간의 양은 접시에 우물의 수에 따라 달라집니다. 예를 들어, 일반적으로 약 5-10 분 소요됩니다. 마르도록 96도 접시에있는 우물을위한지만 30까지 소요될 수 - 40 분 더 큰 포맷으로 24도 접시를 사용하는 경우. 올바르게 가난한 SCG 첨부 파일에있는 우물 결과를 건조하지 않으면. 그런 다음 2 μg / ML의 laminin의 솔루션을 사용 절차를 반복하십시오. 당신이 접시하여 뉴런을 (단계 1.14)에 준비가 될 때까지 37 ° humidified CO 2 배양기에서 C에서 적어도 2 시간의 laminin 솔루션을 품어.
- 상업적으로 획득 임신 여성 쥐나는 CO 2를 사용하여 euthanized있다. 70 % 에탄올과 함께 시신을 분사 후 U 형 절개는 복부 주변에 만들어졌다. 피부를 다시 필링 후, 두 번째 U 자형 절개는 복부 근육 벽을 통해 이루어집니다. 자궁이 복부 근육 레이어를 리프팅시 볼 수 있습니다. 15 자궁과 장소를 제거cm 요리. 조심스럽게 내 새끼 손상을 방지하기 위해 무딘 가위를 사용하여 자궁을 엽니다. 각각의 강아지가 그 배아 골목에서 출시되어야 탯줄이 절단하고, 강아지는 70 %의 에탄올과 Kimwipes로 깨끗이 닦아.
- 절개 후드에서 작업, 몸통에서 머리를 전단에 의해 태어나지 않은 E21의 쥐 새끼를 희생. 그냥 어깨 위에, 목 기지에서 가위를 목표로합니다. 신경을 폭로하기 위해 세 지역에 23 G의 바늘을 사용하여 머리 (최대 목은 쪽) 파악 :; II) 앞쪽에 피부가 코에 걸쳐 뽑아와 고정된; I) 척수를하며 3) 식도 / 기관이 멀리 꼼짝못한다 목 기지에서.
- 경동맥 동맥 분기점 (태아 당 두 SCGs)의 양쪽에 위치 두 SCG에 * 찾아보십시오. SCG는 단지 지점 아래에 위치하고 있습니다. 떨어져 분기 벗어서 동맥에서 SCG를 분리합니다. L15 미디어 얼음 15 ML 원뿔 튜브 (0.4 % D (+)-글루코오스와 보충)의 12 ML에 신경 구를 놓습니다.
* SCG는 분기점을 둘러싸는 불투명, 노란 지방 조직에 비해 투명하고 무색이다. 신경 구를 수집하기 전에 잔여 지방 조직 및 혈액 혈관의만큼을 제거하십시오.
- 모든 SCGs는 배아에서 수확되기 전까지는 1.4과 1.5를 반복합니다.
- 부드럽게 600 rpm으로 1 분 동안 신경을 원심 분리기 및 초과 미디어 기음.
- L15 미디어 함유 트립신 (0.25 %, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)없이) 및 collagenase (1 밀리그램 / ML) 1 ML에 신경을 Resuspend. 37에서 30 분 동안 품어 ° C에서 매 10 분 선동.
- 600 rpm으로 1 분을위한 트립신 및 원심 분리기를 inactivate하는 C-미디어 (1X MEM, 0.4 % D (+)-글루코오스, 2 개의 MM L-글루타민 10 % FBS)의 10 ML을 추가합니다.
- 가능한 * 등 트립신 / collagenase 미디어를 제거하고 C-미디어 10ml와 신경 구를 씻는다. 600 rpm으로 1 분 동안 원심 분리기. 일단이 단계를 반복합니다.
* 잔여 collagenase가 interfe합니다문화 접시에 세포 부착에 필요한 콜라겐 기판과 함께 다시.
- 세차 미디어를 제거하고 C-미디어의 1 ML에서 다시 정지 신경 및 세포 *의 대형 대단히 짧은 시간을 해리하는 5 ML의 주사기에 부착된 21 G 바늘을 사용 씹다. 보이는 대단히 짧은 시간이 dissociated 때까지 23 G 바늘로 triturating 마침.
* 이것이 세포를 손상하므로 아닌 이상 - 씹다에주의하십시오. 트립신과 collagenase 치료가 성공했다면 십오 최대 위아래로 21 G 바늘과 사이클 및 23 G 바늘 든 세 사이클이 충분해야합니다.
- 70 μm의 나일론 필터 [BD Biosciences 셀 스트레이너]를 통해 dissociated 뉴런을 필터링하는 나머지 대단히 짧은 시간을 폐기하기 위해 50 ML 원뿔 튜브로.
- 필터링 세포 현탁액, 라이브 세포의 수를 결정하기 위해 trypan과 청색의 혼합의 10 μl 나누어지는을 철회. 적극적으로 excl 세포의 수를 세어hemocytometer를 사용하여 ude 염료.
- 37 ° C 배양기 (STEP 1.2 참조)에서 기다리고 96 잘 요리에서 laminin 솔루션을 제거합니다. laminin이 제거되면 접시를 건조하지 마십시오, 그것은 도금 세포를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. 콜라겐과 laminin 미리 코팅된 96 잘 조직 배양 접시에 - * 5,000-6,000 총 살아있는 세포를 (물론 당 100 μl 50) 분배. C-미디어 50 NG / ML 신경 성장 인자 (NGF)를 포함합니다.
항생제는 성장 미디어에서 생략되기 때문에 * 그것은 좋은 무균 조직 배양 기술을 채용하는 것이 중요합니다. 또한, 서로 다른 공급 업체로부터 공급 콜라겐 사이에 상당한 변화가있을 수 있습니다. 우리는 Millipore에서 쥐의 꼬리 콜라겐을 사용하여 일괄 처리에 걸쳐 일관된 결과가 있었 잖아요.
- 포도당, 2 MM L-글루타민, 50 NG / ML NGF를 포함하는 B-27 보충제, - DIV (체외에서 일) 1시, 50 μl NBM (0.4 % D (+)와 접시 전지에 사용되는 C-미디어를 대체 5μm의 제품 aphidicolin 및 20 μm의 5-fluorouracil [5 - 플루오로-2'-deoxyuridine]. 5 일째 문화 *을 품어. 이 시점에서 trypsinizing 여러 우물에 남아있는 세포를 계수하는 것은 안티 mitotic 에이전트 치료를 살아남은 뉴런의 수를 결정할 수 있습니다. 일반적으로 약 1,000 뉴런은 96 잘 접시에 잘 따라 남아 있습니다.
곰팡이 또는 세균 오염과 * 문제는 문화의 첫 24 시간 이내 분명 있습니다. 이전 도금 미디어 교체에 대한 미생물의 성장을 위해 신중하게 잘 각각을 검사합니다. 우물만이 제한된 수의 영향을받는 경우, 그들은 PBS로 씻어서 실험을 진행하기 위해서는 건조 묽은 표백제 솔루션으로 치료할 수 있습니다. 우리는 우물의도 제한된 수의 미생물 오염을 가지고 어떠한 실험을 반복하는 것이 좋습니다. 광범위한 미생물 오염이 96 잘 접시에서 관찰되는 경우 실험은 중단되어야한다.
2. 컬트를 SCG의 감염지연의 HSV-1 Us11-EGFP와 설립과 ures
기본적인 바이러스 전파, 결정 바이러스 titer 및 감염 (방어)의 다수를 포함한 virological 기법에 대한 유용한 배경은 독자가 5를 참조라고합니다. herpesvirus 생물학의 논의 내용은 리더가 6 참조라고합니다. 마지막으로, 독자는 SCG 뉴런의 알파 herpesvirus lytic 감염에 관한 이전 예제, 기타 프로토콜 및 추가 배경 및 지연과 재활 성화를 공부하기위한 프로토콜의 adaptations과 비교를위한 7-10 레퍼런스라고합니다.
- DIV 6 각 잘 *의 기존 미디어에 아시 클로 비어 (ACV), 최종 농도 100 μm의를 추가합니다. 각각은 50 μl를 포함 예를 들어, 300 μm의 ACV 주식의 25 μl를 추가합니다. 일반적으로, ACV는 감염 전날 밤에이 추가되고, 또한 감염 이전 6-8 시간을 추가할 수 있습니다.
*이 전직입니다항상 신경 세포의 불필요한 물리적 조작을 최소화하기 위해 ceedingly 중요합니다. 간단히 제거하고 미디어를 교체 또는 바이러스 주식과 감염은 매우 부드럽게 천천히 수행되어야합니다. 그렇지 않으면, 결과 기계적인 스트레스는 부정적인 뉴런의 생존 능력에 따라 영향을 미칠 수 있습니다.
- DIV 7시, 1 -2 사이의 감염의 다수 (방어) (최적의 방어를 결정에 아래의 중요한 주석 참조)에서 HSV-1 Us11-EGFP (심판 11에 설명한)와 SCG 문화를 감염 *. 직접 잘의 기존 미디어에 희석 바이러스를 추가합니다. 모의에 감염된 제어 및 ACV 부족 미디어 lytic 감염 긍정적인 컨트롤을 포함합니다. 감염이 37에서 2-3 시간 동안 진행하도록 허용 ° C.
* 입니다만는 Vero 세포를 12 단계 1.14에 잘 따라 놓는 도금, 살아있는 세포의 수가 상패 분석을 수행하여 결정 바이러스 titer를 사용하여 계산됩니다. 이 계산은 단지 운영 의미에서 유용합니다전체 휴대폰 번호로 씨앗은 오염 glia, 그리고 섬유아 세포 함께 뉴런이 포함되어 있습니다. 이러한 오염 나누어 세포 백신 mitotic 요원과 치료에 의해 살해대로 살아남은 뉴런에 대한 방어 효과가 실제로 큽니다. 5,000 초기부터 수량에서 - 6000 라이브 세포, 약 1,000 뉴런은 안티 mitotic 요원 (같은 trypsinizing와 직접적인 세포 계수에 의해 평가)와 치료 후에도 남아 있습니다. 의 연결을 문화를 감염 때 사용할 입니다만 최적화된 하나의 바이러스 주식 준비에서 다음 다소 다를 수 있습니다. 바이러스의 모든 새 준비, 우리는 다른 방어의 1에서 2로 제한된 범위를 테스트하는 것이 좋습니다. 여기서 목표는 신경 세포의 생존과 inducible의 재활 성화 이벤트 (섹션 3에서 정의한)의 최대 다수 결과시 최소 효과를 가지고 하나를 식별하는 것입니다. Us11-EGFP 바이러스는 빠르게 조건 최적화에 특히 유용하지만 그 중 하나가 또한 플라크 분석이나 quanti 같은 다른 설치 했어요 사용할 수 있습니다tative PCR. 그것이 순수하고 일상적으로 수행되지 아니지만, 세포 생존을 줄이고 불순물을 제거하는 자당 쿠션을 통해 정화 바이러스를 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 50 NG / ML NGF 및 100 μm의 ACV *를 포함하는 새로운 NBM과 함께 감염 미디어를 조심스럽게를 교체하십시오.
* 그것은 감염 미디어를 변경할 때 매우 부드럽게 될 매우 중요하다. 우물 벽에보다 잘 하단의 피펫의 팁을 겨냥해서 미디어 가볍게 세포로 아래로 미끄러 수 있습니다. 피펫의 미디어에도 급속한 방출은 기판에서 axons를 분리하고 세포가 세포의 시트로 일반적으로 오프 슬라우시킬 수있는 충분한 힘을 생성할 수 있습니다. 뉴런 분리 (20~30%)의 제한된 경우에만, 결과는 세포가 건강하게 나타 제공하는 최소한입니다. 단독 뉴런은 시간이 지남에 다시 첨부 가능성이 있지만 axons 더 이상 멋지게 연장되지 않습니다D 새로운 axons가 regrow 것입니다. 최적되지 않지만 우물의 단지 제한된 수의 영향을받는 경우 실험 진행할 수 있습니다. 뉴런의 광범위한 분리 (70~80%)이있다면, 우리는 실험에 영향을 잘 (들)을 포함하지 않는 것이 좋습니다. 우물의 대다수 70~80% 단독 뉴런을 포함한다면, 우리는 실험을 종료하는 것이 좋습니다. 뉴런이 아직 다시 첨부 수도 있지만, 그들은 일반적으로 대형 대단히 짧은 시간을 형성합니다. 이것은 개별 활성화 뉴런의 적절한 평가를 복잡. 우리는 분리된 뉴런과 우물이 재활 성화 율은 우물에 대한 뉴런의 차등 준수 영향을받지 않겠다고 보장하기 위해 관찰되었다 어떤 실험을 반복하는 것이 좋습니다.
또한, 항상 부드럽게로서 가능성이 아니라 문화를 처리하는 것이 중요합니다. 불필요한, 갑작스런 움직임 (반복 개통을 포함하고 인큐베이터 챔버 도어 여기서 종결) 또는 강제 미디어 응용 프로그램이 사용자로부터 기계적 응력ould 타협 가능성이 주어진 실험에 자발적 재활 성화의 unacceptably 높은 속도의 결과로, HSV-1 대기 시간을 지원하는 문화 능력.
- 바이러스가 대기 시간을 설정할 수있는 시간 동안 6 일간의 문화를 유지합니다. 이 기간 동안 lytic 복제의 지표로서 신경 세포의 건강과 Us11-EGFP 발현을 모니터링하기 위해 형광 현미경을 사용합니다. Us11-EGFP는 성공적인 일차 감염과 생산적인 lytic 복제를 나타내는 전용 ACV 치료를 부족 제어 우물에서 발견되어야한다. 뉴런도 생산적인 바이러스 성장의 부재에 cytopathic 효과를 보여줄 수 있습니다. 감염된 문화가 밀접하게 모니터링 및 모의에 감염된 뉴런과 비교해야합니다.
3. 재가입 및 평가
- DIV 14 살이면 신중하게 ACV이 부족해 새로운 미디어 ACV 함유 미디어를 대체합니다. 적절한 경우,이 시간에 pharmacological (또는 생물 학적) 변수를 포함합니다. 해라의2.3에 명시된주의 사항을 따르도록 우레.
- 5 일에서 6 일간 걸쳐, 재가입을 겪고 뉴런을 감지하는 형광 현미경을 사용하여 라이브 문화를 모니터링합니다. 또는 다른 유형의 분석 (단백질, 핵산, 상패 분석 등)에 대한 샘플을 수집합니다.
- EGFP-긍정적인 뉴런을 포함하는 우물의 개수를 세어 재가입 주파수를 계산 및 샘플 우물의 총 개수의 비율로 표현. 개인의 EGFP 발현이 잘 기본 재가입 이벤트와 바이러스 확산으로 인한 후속 감염을 구분하지 않습니다. 감염 확산이 잘 단일 문화에 포함되어 있기 때문에, 잘 하나 이상의 EGFP-긍정적인 뉴런은 운영 체제는 이러한 조건 하에서 한 재가입 이벤트로 정의됩니다.
1에 설명된대로 * 여러 재활 성화 행사, 문화에 발생할 수 있습니다. reac으로 인한 바이러스 전염의 주요 재가입 이벤트를 구별하려면 tivation는 encapsidation 억제제 WAY-150138을 추가할 수 있습니다. encapsidation를 차단함으로써, 전염성 바이러스가 생산하고 재가입으로 인한 전염되지 않는가 불가능합니다. 따라서, WAY-150138의 면전에서 감지된 EGFP 신호가 잘 1,13-15 그을음 문화 내에서 독립적인 재활 성화 이벤트의 수를 반영합니다. WAY-150138는 상용에만 HSV-1 패튼 변형에 대한 효과적이고하지 않습니다. WAY-150138에 대한 대안으로서 다음 중 하나를 사용하여 고려하십시오 : I)가 인접 세포로 확산하는 기능에 장애 돌연변이 바이러스가 활용할 수 있으며, EGFP가 계속 존재에 IE를 발기인으로 표현된다 II) 기자 바이러스 IE의 유전자 산물에 대한 감독 immunofluorescence 이용한 항체 이어 후반 유전자 발현 (및 전염성 바이러스 제작) 방지하는 PAA 또는 ACV와 3) 치료, ACV니다.
4. 분석을 사용하여 재가입을 평가하기위한 대체 방법
개인, 한 실험에서 ontent "> 결과는 SCG의 단일 준비에서 얻을 수 있습니다. 각 복제가 하나의 SCG 배치를 사용하여 실시되었다로서 복제 실험을 한 독립 SCG의 준비를 수행할 수 있습니다.- HSV-1 lytic 성적의 평가. 재활 성화의 여러 실험 inducers의 유무에 ACV 제거 후 원하는 시간에 RNA를 수집합니다. 96 잘 배양 접시를 사용하는 경우, 우리는 (RNA 샘플 당 약 10 5 세포) 각 샘플 함께 최소 20 우물을 풀링하는 것이 좋습니다. 또는 SCGs은 (24 잘 접시, / 잘 4-5 x10 4 셀을 사용하는 예) 큰 우물에 도금 수 있습니다. 그것은 20 명 미만 우물, 작은 볼륨 부당한 샘플 투 샘플 변화에 관련된 결과로부터 RNA를 탐지하기 위해 정말로 가능할 것입니다 동안.
- HSV-1 lytic 단백질의 탐지. 재활 성화의 유도 후 원하는 시간에 lysates를 수집합니다. 10w 각 용해 버퍼의 7.5 μl 추가96 잘 접시에 ells 및 SDS-PAGE와 immunoblotting으로 분석합니다. 또는 바이러스성 단백질은 간접 immunofluorescence 현미경까지 감지가 가능하다. 초기 도금은 (1.10 참조) 이러한 콜라겐과 laminin의 응용 프로그램에 이전 폴리-D-라이신 (0.2 밀리그램 / ML, 시그마)로 사전에 코팅되었습니다 멸균 유리 coverslip 같은 이미징을위한 장착형 기판에 수행되어야합니다 .
- 전염성 입자 감지. 재가입시 문화 뜨는 수집합니다. 뜨는의 시리얼 dilutions를 사용하여 Vero 세포 monolayers에 상패 분석을 수행합니다. 또한 플라크의 assays는 titer를 결정하는 셀 - 관련 입자를 포함하는 동결 - 해동 문화 lysates를 사용하여 수행할 수 있습니다.
5. 대표 결과
그림 2A 1 μm의 제품 trichostatin이 (TSA), 재가입 16-18의 알려진 유도가, 야생 형 H와 latently 감염된 문화를 SCG에 적용되는 예제를 보여줍니다SV1 EGFP-Us11 기자의 변형. TSA로 재가입은 2 일 이내에 최대 50 % 도달, 5 일 우물의 약 60 %의 재활 성화에 의한 대지. 베이스 라인 ( '자발적') 재가입이 실험에서 약 10 %이며, 일반적으로 체외 시스템에서 이것을 사용 10-20%에서 범위. 최대 재가입 수준은 재활 성화 유도 인자가 활용되는에 따라 다릅니다. 대부분의 재활 성화 inducers들은 생산적인 바이러스 복제를 방해하지 않기 때문에 실험 기간 동안 적용, 그러나 이것은 경험적으로 판단해야 할 수 있습니다. 뉴런의 생존에 영향을하거나 바이러스 생산적인 생활주기의 완료를 방해하는 시약을 포함한 다른 inducers은 과도 펄스 응용 프로그램이 다시 활성화를 유도할 수 필요할 수 있습니다.
그림 2A에 묘사된 실험의 각 우물에 EGFP-Us11의 축적은 대기로부터 재가입 지표이지만, 그것은 구분하지 않는다 여부개별 뉴런의 Us11-EGFP 신호가 독립적인 재활 성화 행사 또는 문화를 통해 활성화 바이러스의 확산에서 파생됩니다. 각도의 독립 재가입 이벤트를 진행 뉴런의 개수를 평가하기 위해, 문화는 길을-150138, 특히 바이러스의 DNA 게놈 13-15의 encapsidation을 방지하여 바이러스 확산을 차단 화합물 사전 처리되었습니다. 감염된 교감 신경 세포 배양은 WAY-150138와 TSA로 유도된 재활 성화로 치료되었다. EGFP-긍정적인 뉴런의 상당 숫자는 독립적인 재활 성화 이벤트의 숫자 (그림 2B) 각 문화마다 발생하는 것을 보여주는, DMSO-대우 제어 문화에 비해 TSA-대우 우물에서 발견되었다.
우리의 분석에서는 Us11-EGFP 기자는 내생 Us11 발기인 11 일부터 표시됩니다. Us11이므로는 "진정한 늦은"또는 γ이 바이러스성 lytic 유전자, 바이러스의 DNA 복제는 강력한 expressi 필요합니다에. EGFP-Us11 축적은 PI3 - 키나 아제 억제제 LY294002로 재활 성화에 시달릴 문화에서 바이러스의 DNA 중합 효소 억제제 phosphonoacetic 산 (PAA)에 의해 손상되기 때문에 이것은 그림 3과 그림한다.
1 그림. HSV-1 지연과 재활 성화를 공부 체외 시스템에서 교양 신경 세포를 사용하여 일반적인 실험 프로토콜을 보여주는 도식. 1) E21 쥐에서 우수한 경추 신경 (SCG)를 해부 후 dissociated 뉴런은 96 잘 요리 도금하고 안티 mitotic로 치료 요원들은 비의 연결 세포를 제거합니다. 2) 시험 관내 (DIV) 6 일 후에 문화가 존재 아시 클로 비어 (ACV), 항바이러스 약물에 바이러스 인코딩된 Us11 늦은 유전자 (EGFP-HSV-1)에 융합 EGFP를 포함 재조합 HSV-1에 감염됩니다 블록 lytic 복제. 3) 일 14함으로써 (DIV 14), 아시 클로 비어가 제거되고 EGFP 표현발견되지 않습니다. 문화가 안정적으로 일개월 이상 이러한 방식으로 유지되어야하거나 테스트 변수는 대기에서 재가입을 자극하는 능력을 평가하기 위해 추가할 수 있습니다. 변수는 어느 유전자에 특정한 shRNA 또는 ectopically 표현 단백질을 표현하는 작은 분자의 화학 억제제, 가용성 neurotrophin이나 세포 표면 단백질에 대한 항체, 또는 lentivirus의 형태가 될 수 있습니다. 재가입 그때 실시간으로 EGFP-긍정적인 우물에서 점수에 의해 모니터링된다.
그림 2. TSA는 SCG 문화에 HSV-1을 reactivates. 그림 1에 설명된대로 SCG 문화가 latently 감염되었다. DIV 14 살이 ACV는 미디어는 1 μm의 제품 trichostatin를 포함하는으로 제거하고 대체되었습니다 (TSA).에게 () 문화는 시각 5 일 기간 동안 약물 치료 후 매일 형광 현미경을 사용하여 득점했다. reactivat를 겪고 우물의 비율실험 과정 이상의 이온은 DMSO 제어 처리의 문화에 비해 표시됩니다. 재활 성화의 비율은 96도 문화 판 20 위 밖으로 EGFP-긍정적인 우물의 숫자로 계산되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. (B) Latently 감염 문화는 TSA와 바이러스의 DNA encapsidation의 저해제, WAY-150138 (20 μg / ml) 쇼핑로 치료되었다. EGFP + 뉴런의 갯수는 DMSO와 WAY-150138 대우 컨트롤에 대한 약물 치료 후 48 시간을 비교했다. 각 데이터 포인트 잘 문화 1,000 뉴런의 EGFP + 뉴런 밖의 비율을 나타냅니다. 바 잘에서 EGFP의 평균 비율 + 뉴런 보여줍니다.
그림 3. EGFP의 detecion 바이러스는 DNA 복제에 따라 달라집니다. SCG 문화 latently 후 LY29004, 재가입 1의 알려진 유도 10 μm의 대우에 감염되었다. LY (파란색) WA에 의해 유도된 재가입S는 바이러스의 DNA 합성 억제제, phophonoacetic 산성, PAA (300μg/ml, 빨강)와 함께 두 화합물 (녹색)로 치료가 이들에 비해.
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Discussion
이 예비 신경 세포 문화 및 감염 시스템은 HSV-1 지연과 재활 성화를 밑에있는 분자 메커니즘을 탐구하기위한 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 시스템은 충실히 recapitulates 인간 감염 모두에서, 라이브 - 동물 모델에서 정의된 대기 시간의 인정된 특징을. 바이러스가 SCG 문화에 숨어있는 경우, 전염성 입자와 바이러스 lytic 유전자 제품은 감지되지 않습니다. latently에 감염된 뉴런에서 검색된 유일한 바이러스성 유전자 산물이 핵 내에 축적 비 코딩 LAT 성적 증명서입니다. 재가입 바이러스는 lytic 유전자의 표현과 일치하며 전염성 입자의 생산에 culminates. 또한,이 일차 신경 세포의 세포 배양 모델은 효과적으로 lytic 바이러스 복제를 유도 TSA 등 허용 재활 성화 inducers에 반응입니다.
다른 화학 inducers는 다양한 extents에 재가입을 자극하고 특성과 속도론. 예를 들어, TSA는 reproducibly 5 D 관찰 기간 동안의 문화 60-70%에 재가입을 유도합니다. TSA-유도 재가입의 비슷한 수준의 18 PC12 세포를 17 murine 삼차 신경 세포 배양 latently에 감염된, 차별화된 쥐 pheochromocytoma를 사용하여보고되었습니다. 재활 성화의 운동이 우리가 관찰하고 문화의 100 %를 재활 성화 TSA의 무능력은 derepressed되는 잠재 genomes의 용량에 이질을 반영 수 있습니다. 이 제안과 일치, TSA-유도 재가입의 효능 보도 문화 18의 시간의 함수로 줄어 듭니다. TSA와는 달리, LY29004 2-3 D 사이의 문화 80~90%에 재가입을 유도합니다. 지연 시간을 설정하거나 방어 차이는 지연 시간을 설정을위한 조건이 reproducibly 바이러스 인코딩된 지연 엉덩이를 표현하는 뉴런의 약 20 %의 결과로서, TSA와 LY29004 사이 inducible 재활 성화의 차이에 달한다 가능성이 없습니다ociated 사본 LAT 1. 그러나 아직 LY29004는 TSA보다 뉴런의 큰 숫자에 재가입을 유도하는 가능성을 높여, 바이러스성 게놈 양성 세포의 분율을 측정하지 않았습니다. 재활 성화를 유도하기 위해 TSA와 LY20004의 차등 용량의 기본 이유는 결정하기 위해 남아 있지만, 다른 유도 대리인 특성 효율성과 속도론과 재활 성화를 홍보할 수 분명하다.
시스템의 강력한 양상은 야생 형 바이러스 indistinguishably 행동 야생 형 바이러스 또는 기자 변종을 사용하는 능력입니다. 20 검토한 생산 16,18,19를 복제할 수 없었습니다 돌연변이 HSV 변종에 의존 HSV-1 대기 시간을 공부 초기 세포 배양 시스템과는 달리, 우리의 모델 시스템은 야생 형에서 구별할 수있다 EGFP-기자의 변형을 포함 교양 세포 11 lytic 복제 효율성의 관점에서 바이러스. EGFP 기자 V의 사용irus은 대기와 재활 성화의 민감하고 간단 시각적인 평가를 얻을 수 있습니다. 이러한 고정 및 분석을위한 세포의 용해가 필요 β-갈락토 같은 다른 기자와는 달리, EGFP가의 편리한 실시간 평가를 제공하고, 연구자가 실험의 전체 과정에 걸쳐 바이러스 상태를 모니터링할 수 있도록 자연과 유도 재활 성화. 다른 방법은, 양적 PCR처럼 또 EGFP는 "진정한 늦은"유전자, 또는 리포터 유전자를 결여 바이러스 변종에 대한로 표현되기 때문에 EGFP-식을 선행 바이러스성 유전자 발현 패턴을 보면서 이런 생각을 활용할 수 있습니다. 또는, EGFP가 (IE) 즉시 - 초기 또는 초 (E) 유전자에 융합되는 다른 기자 바이러스는 개발 수 있습니다. 설명 "진정한 늦은"EGFP-리포터를 사용하는 장점은 그 EGFP 표현 바이러스 라이프 사이클은 lytic 성장과 관련된 최종 유전자 발현 단계로 진행되었음을 나타내는 바이러스성 DNA 합성시 stringently 의존입니다. 산업eed, 육안 검사에 의해 감지 수준으로 "진정한 늦은"EGFP 발현은 생산성을 재활 성화가 발생하는 전염성 바이러스 생산, 생물 학적 지표와 잘 연결합니다. 그러나, 같은 생산 사이클 (lytic) 유전자 발현에 의해 측정된 재활 성화를 개시 각각의 신경 세포가, 전염성 바이러스를 생산하는 완전한 lytic 프로그램을 통해 진행 능력이 있는지두고 봐야 알겠죠. 아마도 바이러스 취소 lytic 프로그램을 충분한 기회를 갖게 및 지연 시간을 다시 설정. 따라서 IE 또는 E 단백질에 융합 EGFP을 표현 기자 바이러스 덜 안정적인 재활 성화 설치 했어요 발생할 수 있습니다. 이러한 관점에서 재가입의 효율성을 비교하는 것은 IE, E, 또는 늦은 발기인, 심지어 각 운동 클래스에서 유전자 산물에 융합 서로 다른 형광 기자 단백질과 결합된 기자의 표현 EGFP-리포터를 사용하여 측정 (IE 대 전자 대 하순)가 유용할 것입니다. 또한, 우리의 연결을 세포 배양 시스템은 또한 다른 HSV-1의 일 함께 사용할 수비가 상관없이 자신의 neuroinvasive 가능성 또는 숙주 면역 반응 21-24을 조절하는 능력. 마지막으로, 여기에 설명된 체외 배양 시스템은 인간 25-27 포함한 고차원 종로부터 얻은 다른 세포의 연결 유형 및 전직 생체내 말초 신경 문화에 적용할 수 있습니다.
뉴런의 순수한 인구를 사용하여 분자 수준에서 HSV1과의 연결을 호스트 간의 상호 작용에 대한 자세한 연구는 이제 가능합니다. 중요한 것은이 모델 시스템은 컨트롤의 추가 레벨은 기본적인 바이러스 신경 세포 상호 작용의 상단에 상상을 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가되어 면역 적격 동물에서 공부 지연과 재활 성화와 관련된 여러 복잡한 문제가 발생하지 않습니다. 또한,이 시스템의 작품은 명확하게 바이러스와 설립 및 후천성 면역 반응의 도움없이도 유지 수있는 호스트 신경 세포 간의 안정적인 관계가 실제로있다는 것을 보여줍니다. 타고난 동안과 adaptiv환경에 대한 응답으로 lytic, 생산적인 복제 프로그램으로 전환) 및 II, 전자 면역 분명히 숨겨진 HSV 감염의 생물학에서 중요한 역할을, 바이러스는 본질적인 뉴런에 지연을 닮은 비 생산적인 감염을 확립하기 위해 용량 I)를 가지고 와의 연결을 단서 혼자 뉴런에 적용. 중요한 것은, HSV와 신경 세포 사이의 독특한 관계에 대한 분자 기초는 현재 세포 생물학, pharmacological, 유전자 입을 및 유전자 전달 도구 1을 사용 해부를 할 수 있습니다. 절연에 신경 세포 및 바이러스에 집중되는 이런 종류의 연구는 여러 세포 유형 ganglial 구획을 차지하고 동물 모델이 가능하지 않습니다. 우리는이 모델 시스템을 사용하여 복잡한 분자 회로의 포괄적인 이해가 마침내 얻을 수 뉴런에서 HSV-1 대기 시간을 조절 있기를 바랍니다. 가능하다면,이 교양 신경 세포 시스템에서 gleaned 원칙은 다음 설립된 동물 MO를 사용하여 생체내에서 테스트할 수HSV-1 대기의 전반적인 연구로이 두 가지 접근법의 보완적인 성격을 보여주는 dels.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 원고를 개선하는 데 도움이 그들의 사려깊은 제안 리뷰어 감사드립니다. 이 작품은 NIH에서 MVC (NS21072, HD23315) ACW (GM61139, S10RR017970)와 메신저 (AI073898, GM056927)에 교부금에 의해 지원되었다. MK는 NIH 연수 보조금 (5T32 AI007180)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma-Aldrich | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | EMD Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
References
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