Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Published: April 2, 2012 doi: 10.3791/3823
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Summary

Protokollet beskriver en effektiv och reproducerbar modell för att studera herpes simplex-virus typ 1 (HSV-1) latens och reaktivering. Analysen använder homogena sympatiska neuron kulturer och möjliggör den molekylära dissektion av virus-neuron interaktioner med hjälp av olika verktyg, bland annat RNA-interferens och uttryck av rekombinanta proteiner.

Abstract

Herpes simplex virus typ-1 (HSV-1) upprättar ett livslångt latent infektion i perifera nervceller. Denna latenta reservoar är källan till återkommande reaktivering händelser som garanterar överföring och bidra till klinisk sjukdom. Nuvarande antivirala inte påverkar inte den latenta reservoaren och det finns inga vacciner. Medan de molekylära detaljerna i lytisk replikering är väl kännetecknas mekanismer som styr latency i nervceller kvar svårfångade. Vår nuvarande förståelse av latens är härledd från in vivo-studier med användning av små djurmodeller, vilka har blivit oundgängliga för att definiera virala genprodukter krav och rollen av immunsvar. Det är emellertid omöjligt att särskilja specifika effekter på virus-neuronen förhållande från mer generella konsekvenserna av infektion som medieras av immun-eller icke-neuronala stödceller i levande djur. Dessutom är djurförsök kostsamt, tidskrävande och begränsade i form av tillgängliga alternativ för att manipulera värdenprocesser. För att övervinna dessa begränsningar, är en neuron-system med enbart ett desperat behov av att återger in vivo egenskaper latens och reaktivering men erbjuder fördelarna med vävnadsodling i termer av homogenitet och tillgänglighet.

Här presenterar vi ett in vitro-modell att använda odlade primära sympatiska nervceller från råtta överlägsna cervikala ganglier (SCG) (Figur 1) för att studera HSV-1 latens och reaktivering som passar de flesta om inte alla önskade kriterier. Efter eliminering icke-neuronala celler, är nästan homogena TrkA + neuron kulturer infekterades med HSV-1 i närvaro av acyklovir (ACV) för att undertrycka lytisk replikation. Efter ACV bort, icke-produktiva HSV-1 infektioner som troget uppvisar accepterade kännetecken latens effektivt etablerade. Noterbart lytiska mRNA, proteiner och infektiöst virus blir odetekterbar, även i frånvaro av selektion, men latens-associerad transkript (LAT) uttryckerion kvarstår i neuronal kärnor. Virala genom hålls vid en genomsnittlig kopietal av 25 per neuron och kan induceras att produktivt replikera genom att interferera med PI3-kinas / Akt-signalering eller den enkla tillbakadragande av nervtillväxtfaktor 1. En rekombinant HSV-1 kodning EGFP smält till det virala lytiska proteinet US11 ger en funktionell, real-time markör för replikering till följd av reaktivering som lätt kvantifieras. Förutom kemiska behandlingar kan genetiska metoder såsom RNA-interferens eller gentillförsel via lentivirala vektorer med framgång tillämpas på systemet som medger mekanistiska studier som är mycket svåra, om inte omöjligt, i djur. Sammanfattningsvis ger SCG-baserade HSV-1 latens / reaktivering systemet ett kraftfullt, nödvändigt verktyg för att reda ut de molekylära mekanismer som styr hsv1 latens och reaktivering i nervceller, en lång stående pussel i virologi vars lösning kan erbjuda nya insikter för att utveckla nya terapier som Målet tHan latent herpesvirus reservoar.

Protocol

1. Isolering och kultur SCG nervceller från råttembryon

För att ge en användbar kontext för att förstå detta protokoll, och för en omfattande diskussion av tidigare litteratur som etablerade metoder för SCG neuron kultur, inklusive grunden för SCG odling in vitro, plåt-beläggning av substrat, och komponenterna av serum-fria medier, Läsaren hänvisas till referenserna 2-4.

  1. Användningen av råttor som en källa för SCG neuroner utfördes i enlighet med NIH riktlinjerna i enlighet med ett aktivt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care & Use Committee (lACUC).
  2. Innan dissektion, förbereda kollagen och laminin belagda 96 och vävnadskultur rätter. Användning av en flerkanalig pipetteringsanordningen, fylla alla 96 brunnarna med en lösning innehållande 0,66 mg / ml råttsvanskollagen. Omedelbart ta bort kollagen, som kan återvinnas och användas i upp till 8 dissektioner. Efter avlägsnande than kollagen, är det mycket viktigt att låta brunnarna torka under en huv med laminärt flöde. Den tid det tar att torka beror på antalet brunnar i skålen. Till exempel tar det typiskt cirka 5-10 minuter. för brunnar i en 96 brunn skål för att torka, men kan ta upp till 30 - 40 min vid en större format 24 brunnsskål används. Underlåtenhet att korrekt torka brunnarna resulterar i dålig SCG fastsättning. Därefter upprepas förfarandet med en lösning av 2 | ig / ml laminin. Inkubera laminin lösningen på minst 2 timmar vid 37 ° C i en fuktad CO 2 inkubator tills du är redo att plattan dina neuroner (steg 1,14).
  3. Kommersiellt erhållen dräktiga råttor avlivades med användning av CO2. Efter sprutning av kroppen med 70% etanol, är en U-formad incision i buken. Efter avskalning tillbaka huden, är en andra U-formad incision genom bukmuskeln vägg. Livmodern är synlig på att lyfta upp bukmuskeln lagret. Ta bort livmodern och lägg i en 15cm skål. Öppna försiktigt livmodern med hjälp av en trubbig sax för att undvika att skada valparna inom. Varje valp ska släppas från sin embryonal SAC, navelsträngen avskurna och valpen torkas rena med 70% etanol och Kimwipes.
  4. Att arbeta på en dissektion huva, offra ofödda E21 råttungar genom skjuvning huvudet från bålen. Sikta saxen vid basen av nacken, strax ovanför axlarna. Att exponera ganglierna, stift ner huvudet (nacken uppåt) med 23 G nålar på tre platser: i) ryggmärgen, ii) främre huden dras upp över näsan och nålas och iii) esofagus / luftstrupe måste nålas bort från basen av halsen.
  5. Leta efter två SCG * placerad på endera sidan av den karotiska artären bifurkationen (två SCGs per embryo). Den SCG ligger precis under grenen. Separera SCG från artärerna genom att dra bifurkationen isär. Placera ganglierna i 12 ml L15-medium (kompletterat med 0,4% D (+)-glukos) i 15 ml koniskt rör på is.

* The SCG är genomskinlig och färglös jämfört med opaka, gulaktig fettvävnad som omger bifurkationen. Försök att ta bort så mycket av de resterande fettvävnad och blodkärl, innan insamling av ganglierna.

  1. Upprepa 1,4 och 1,5 tills alla SCGs skördas från embryon.
  2. Försiktigt centrifugera ganglierna under 1 minut vid 600 rpm och aspirera överskottet media.
  3. Återsuspendera ganglierna i 1 ml L15-medium innehållande trypsin (0,25%, utan EDTA) och kollagenas (1 mg / ml). Inkubera under 30 min vid 37 ° C, skaka var 10 min.
  4. Tillsätt 10 ml av C-medium (1 x MEM, 0,4% D (+)-glukos, 2 mM L-glutamin, 10% FBS) för att inaktivera trypsinet och centrifugera under 1 min vid 600 rpm.
  5. Ta bort så mycket av trypsin / kollagenas media som möjligt * och tvätta ganglierna med 10 ml av C-media. Centrifugera under 1 minut vid 600 rpm. Upprepa det här steget en gång.

* Kvarvarande kollagenas kommer interfeär med kollagen underlaget som krävs för cellbindning på den kultur plattan.

  1. Avlägsna tvättmedium och återsuspendera den ganglierna i 1 ml C-medium och finfördela med användning 21 G nål fäst till en 5 ml spruta för att dissociera stora klumpar av celler *. Avsluta triturering med 23 G nål tills synliga klumpar är dissocierade.

* Var noga med att inte över-trituratet eftersom detta kommer att skada cellerna. Om trypsin och kollagenas behandling var framgångsrik, högst femton upp och ned cykler med 21 G-nål, och tre cykler med 23 G-nål bör vara tillräcklig.

  1. Filtrera de dissocierade neuroner genom en 70 pm nylonfilter [BD Biosciences cellfilter] i ett 50 ml koniskt rör att kassera eventuella kvarvarande klumpar.
  2. Dra tillbaka en 10 ul alikvot av den filtrerade cellsuspensionen och blanda med trypanblått för att bestämma antalet levande celler. Räkna antalet celler som aktivt exklude färgämnet med användning av en hemocytometer.
  3. Avlägsna laminin lösningen från de skålar med 96 brunnar som väntar i 37 ° C inkubator (se Steg 1.2). Inte torkar på skålen, kan den användas omedelbart för utstrykning av celler när laminin avlägsnas. Dispensera * 5000-6000 totala levande celler (50 till 100 | il per brunn) i kollagen och laminin förbelagt 96 väl vävnadsodlingsskål. Innefattar 50 ng / ml nervtillväxtfaktor (NGF) i C-medier.

* Det är kritiskt att använda god sterilteknik vävnadskultur eftersom antibiotika är utelämnade från tillväxtmediet. Dessutom kan det finnas betydande variation bland kollagen kommer från olika leverantörer. Vi har haft enhetliga resultat i hela partier med kollagen råttsvans från Millipore.

  1. Vid DIV (dag in vitro) 1, ersätter C-Media används för att platta cellerna med 50 ^ NBM (0,4% D (+) - glukos, 2 mM L-glutamin, B-27 kosttillskott som innehåller 50 ng / ml NGF, 5iM afidikolin och 20 pM 5-fluoruracil [5-fluor-2'-deoxiuridin]. Inkubera kulturerna under 5 dagar *. Vid denna punkt kan trypsinizing och räkna cellerna som finns kvar i flera brunnar bestämma antalet neuroner överlever den anti-mitotiskt medel behandling. Typiskt cirka 1000 neuroner förbli per brunn i en platta med 96 brunnar.

* Problem med svamp-eller bakterieangrepp uppenbarar sig vanligen inom de första 24 timmar med kultur. Undersök varje brunn noga för mikrobiell tillväxt före att ersätta plätering media. Om endast ett begränsat antal brunnar påverkas, kan de behandlas med en utspädd lösning blekmedel, sköljdes med PBS och torkades för att fortsätta med experimentet. Vi rekommenderar att upprepa något experiment där även ett begränsat antal brunnar hade mikrobiell förorening. Om omfattande mikrobiell förorening observeras i 96 brunnar skålen, måste försöket avslutas.

2. Infektion av SCG Cultgärder med HSV-1 US11-EGFP och etablering av latens

För nyttig bakgrundsinformation om virologiska tekniker, inklusive grundläggande virus förökning, bestämma virus titer och mångfald av infektion (MOI), hänvisas läsaren att referera 5. För en diskussion av herpesvirus biologi hänvisas läsaren att referera 6. Slutligen hänvisas till referenser 7-10 för tidigare exempel, andra protokoll och ytterligare bakgrund om alfa-herpesvirus lytisk infektion av SCG nervceller och för jämförelse med våra protokoll: s anpassningar för att studera latens och reaktivering.

  1. Vid DIV 6, tillsätt aciklovir (ACV), slutlig koncentration 100 iM de befintliga media i varje brunn *. Till exempel, om varje brunn innehåller 50 ^ il, tillsätt 25 pl av en 300 fiM ACV lager. Typiskt är ACV tillsattes natten innan infektion, men kan även tillsättas 6-8 h före infektion.

* Det är exceedingly viktigt att minimera onödig fysisk manipulation av neuron vid alla tidpunkter. Helt enkelt ta bort och ersätta media eller smitta med virus lager måste göras mycket försiktigt och långsamt. Annars kan den resulterande mekaniska påfrestningar påverka negativt på neuron livskraft.

  1. Vid DIV 7, infektera SCG kulturerna med HSV-1 US11-EGFP (beskriven i ref 11) vid en mångfald av infektion (MOI) mellan 1 -2 (se viktig kommentar nedan om att avgöra den optimala MOI) *. Tillsätt utspädd viruset direkt till de existerande mediet i brunnen. Inkludera en mock-infekterad kontroll och en lytisk infektion positiv kontroll i media saknar ACV. Möjligt för infektionen att fortskrida under 2-3 timmar vid 37 ° C.

* MOI beräknas med användning av virustiter bestämdes genom att utföra en plackanalys i Vero-celler 12 och antalet pläterade, levande celler såddes per brunn i steg 1,14. Denna beräkning är användbar endast i ett operativt mening,som det totala cellantalet ympade innehåller neuroner tillsammans med kontaminerande glia och fibroblaster. Eftersom dessa kontaminerande delande celler dödas genom behandling med anti-mitotiska medel, är den effektiva MOI för efterlevande nervceller faktiskt större. Från den ursprungliga start mängden 5.000 - 6.000 levande celler, cirka 1.000 neuroner kvar efter behandling med anti-mitotiska medel (enligt bedömning av trypsinizing och direkt cellräkning). Den optimala MOI att använda när infektera neuronala kulturer kan variera något från en virus mäldberedningen till nästa. Med varje nytt preparat av virus, rekommenderar vi att du testar ett begränsat antal olika MOI 1 till 2. Målet här är att identifiera den som har de minst effekter på neuron livskraft och resulterar i det största antalet händelser inducerbara reaktivering (definierat i avsnitt 3). Den US11-EGFP virus är särskilt användbart att snabbt optimera förutsättningarna men man kan också använda andra avläsning som plack-analys eller kvantitativativa PCR. Det kan hjälpa att använda viruset renas genom en sackaroskudde för att avlägsna föroreningar som minskar cellernas livsduglighet, men detta är inte nödvändig och inte rutinmässigt.

  1. Försiktigt ersätta infektion media med färsk NBM innehållande 50 ng / ml NGF och 100 M ACV *.

* Det är oerhört viktigt att vara mycket försiktig när du ändrar infektion media. Rikta pipettspetsen vid väggen av brunnen snarare än vid botten av brunnen, och tillåta mediet att försiktigt glida ner på cellerna. Även en snabb utmatning av media från pipetten kan generera tillräcklig kraft för att lossa axoner från substratet och få cellerna att kasta av typiskt som ett ark av celler. Om endast ett begränsat antal neuroner detach (20-30%), konsekvenserna är minimala, förutsatt att cellerna verkar friska. De fristående nervceller kommer troligen att sätta tillbaka tiden, men kommer axonerna inte längre snyggt förlängas end nya axoner kommer återföds ständigt. Även om det inte optimala, kan försöket fortsätta om endast ett begränsat antal brunnar påverkas. Om det är omfattande avlossning av nervceller (70-80%), rekommenderar vi inte med de drabbade väl (er) i experimentet. Om majoriteten av brunnarna innehåller 70-80 procent fristående nervceller, rekommenderar vi att avsluta försöket. Medan nervceller fortfarande kan sätta tillbaka de oftast kommer att bilda stora klumpar. Detta komplicerar korrekt bedömning av enskilda reaktiverade nervceller. Vi rekommenderar att upprepa något experiment där brunnar med fristående nervceller observerades att reaktivering satser inte påverkades av differentiell vidhäftning av nervceller till brunnarna.

Dessutom är det viktigt att alltid hantera kulturer som försiktigt som möjligen. Mekanisk stress från onödiga, plötsliga rörelser (inklusive upprepad öppning och stängning av en inkubator luckan) eller kraftfull medieprogram cOuld kompromiss kulturer förmåga att stödja HSV-1 latens, vilket kan leda till oacceptabelt höga spontana reaktivering i en given experiment.

  1. Bibehålla kulturer under 6 dagar under vilken tid viruset kommer etablera latens. Under denna period använda en fluorescerande mikroskop för att övervaka neuron hälso-och US11-EGFP uttryck som en indikator på lytisk replikering. US11-EGFP bör detekterades endast i kontrollbrunnarna saknar ACV behandling, vilket tyder på framgångsrika primär infektion och produktiv lytisk replikering. Neuroner kan visa cytopatiska effekter och med i frånvaro av produktiv viral tillväxt. De infekterade kulturer bör övervakas noga och jämföras med skeninfekterade neuroner.

3. Reaktivering och bedömning

  1. Vid DIV 14, noggrant ersätta de ACV-innehållande media med färskt medium som saknar ACV. Om det är lämpligt, innehålla farmakologiska (eller biologiska) variabler vid denna tidpunkt. Vara arure att följa försiktighetsåtgärderna som anges i 2,3.
  2. Under en 5 till 6 dagar, övervaka levande kulturer med hjälp av en fluorescerande mikroskop för att upptäcka nervceller som genomgår reaktivering. Alternativt kan samla in prover för andra typer av analyser (protein, nukleinsyra, plackanalys etc).
  3. Beräkna reaktivering frekvens genom att räkna antalet brunnar innehållande EGFP-positiva neuroner och uttrycka detta som en del av det totala antalet provbrunnar. Notera att EGFP uttryck i en enskild brunn inte skiljer mellan en primär reaktivering händelse och efterföljande infektion på grund av viral spridning. Eftersom smittsam spridning finns en enda kultur Tja, en eller flera EGFP-positiva neuroner i ett väl operativt definierad som en reaktivering händelse under dessa förhållanden.

* Flera reaktivering händelser kan inträffa i en kultur, som beskrivs i 1. För att skilja en primär reaktivering händelse från viral spridning till följd av reaktion motivation kan inkapsidering inhibitorn WAY-150.138 tillsättas. Genom att blockera inkapsling är smittsamt viruset inte produceras och sprids till följd av reaktivering är inte möjligt. Sålunda återspeglar EGFP-signalen detekteras i närvaro av WAY-150.138 antalet oberoende reaktivering händelser inom en enstaka odlingsbrunn 1,13-15. Notera att WAY-150.138 är endast effektiva mot HSV-1 Patton-stam och inte är kommersiellt tillgängliga. Som ett alternativ till WAY-150.138, överväga att använda någon av följande: i) en mutant virus försämras i sin förmåga att sprida sig till angränsande celler kan användas, ii) en rapportörmolekyl virus där EGFP uttrycks från en lE-promotor i den kontinuerliga närvaron av ACV, iii) behandling med PAA eller ACV att förhindra sent genuttryck (och infektiösa virus produktion) följt av immunofluorescens med användning av antikroppar riktade mot en lE-genprodukten.

4. Alternativa metoder för att bedöma Reaktivering med analys

INNEHÅLL "> Resultat från en individ, enda experiment bör erhållas från en enda beredning av SCG. upprepade experiment kan utföras med oberoende SCG förberedelser så länge varje replikat utfördes med en enda SCG parti.

  1. Bedömning av HSV-1 lytiska transkript. Samla RNA vid önskade tidpunkter efter avlägsnande ACV i närvaro eller frånvaro av olika experimentella inducerare av reaktivering. Vid användning av 96 brunnar, rekommenderar vi att samla minst 20 brunnar tillsammans för varje prov (ca 10 5 celler per RNA-prov). Alternativt kan SCGs pläteras i större brunnar (t ex för en 24 brunnars platta använd 4-5 x 10 4-celler / brunn). Det är visserligen möjligt att upptäcka RNA från mindre än 20 brunnar, de små volymer inblandade resulterar i obefogat prov till prov variabilitet.
  2. Detektering av HSV-1 lytiska proteiner. Samla lysat vid önskad tidpunkt efter induktion av reaktivering. Tillsätt 7,5 pl lysbuffert till varje 10 viktalnar i en 96 brunnars platta och analysera genom SDS-PAGE och immunoblotting. Alternativt kan virala proteiner detekteras genom indirekt immunofluorescens-mikroskopi. Den inledande plätering måste göras på ett monterbar substrat för avbildning som en steril täckglas som har förbelagts med poly-D-lysin (0,2 mg / ml, Sigma) före tillämpningen av kollagen och laminin (se 1,10) .
  3. Detektering av infektiösa partiklar. Samla kultursupernatant vid reaktivering. Utföra en plackanalys på monoskikt av Vero-celler med användning av serieutspädningar av den överstående lösningen. Dessutom kan plackanalyser utföras med användning av lysat av frysnings upptinade-odlingar för att inkludera cellassocierade partiklar för att bestämma titern.

5. Representativa resultat

Figur 2A visar ett exempel där 1 nM trichostatin A (TSA), en känd inducerare av reaktivering 16-18 appliceras på SCG kulturer latent infekterade med vildtyp HSV1 EGFP-US11 reporter-stam. Med TSA når reaktivering 50% av den maximala inom 2 dagar, och med 5 dagar reaktivering platåer med ca 60% av brunnarna. Baslinjen ("spontana") reaktivering är ungefär 10% i detta experiment och sträcker sig typiskt från 10-20% med användning av denna in vitro-system. Maximala reaktivering varierar beroende på vilken reaktivering inducerare används. Många reaktivering inducerare kan användas under hela experimentet eftersom de inte stör produktiv virusreplikation, men detta måste bestämmas empiriskt. Andra inducerare, inklusive reagens som påverkar lönsamheten hos de neuroner eller hindrar fullbordandet av den virala produktiva livscykel, kan kräva en transient puls ansökan att provocera reaktivering.

Medan ackumulering av EGFP-US11 i varje brunn i det experiment som visas i fig 2A är en indikation på reaktivering från latens, skiljer den inte huruvidaUS11-EGFP-signalen i individuella neuroner är härledd från en oberoende reaktivering händelse, eller spridningen av en reaktiverat virus genom odling. För att utvärdera antalet neuroner som genomgår oberoende reaktiveringsluft händelser i varje brunn, fick kulturerna förbehandlade med WAY-150.138, en förening som specifikt blockerar viral spridning genom att förhindra inkapsling av den virala DNA-genomet 13-15. Infekterade sympatiska neuron kulturer behandlades med WAY-150.138 och reaktivering inducerades med TSA. Betydande antal EGFP-positiva neuroner har endast upptäckts i TSA-behandlade brunnar, jämfört med DMSO-behandlade kontroll kulturer, visar att ett antal oberoende reaktivering händelser inträffar per individ kultur (Figur 2B).

I vår analys är US11-EGFP reporter uttryckt från den endogena promotorn US11 11. Eftersom US11 är en "sann-sen" eller γ 2 viral lytisk genen, viral DNA-replikation krävas för robust expressividare. Detta illustreras i figur 3, som EGFP-US11 ackumulering försämras av det virala DNA-polymerasinhibitor fosfonoättiksyra (PAA) i kulturer inducerade att reaktivera med PI3-kinas-inhibitom LY294002.

Figur 1
Figur 1. Schema som illustrerar en typisk försöksprotokoll med användning av odlade neuronen in vitro-system för att studera HSV-1-latens och reaktivering. 1) Efter dissekering ganglion cervicale superius (SCG) från E21-råttor, har dissocierade neuroner utströks i 96-brunnsplattor och behandlades med anti-mitotiska medel för att avlägsna icke-neuronala celler. 2) Efter 6 dagar in vitro (DIV) kulturerna infekteras med rekombinant HSV-1 som innehåller EGFP fuserad till viruskodat US11 sena genen (EGFP-HSV-1) i närvaro acyklovir (ACV), ett antiviralt läkemedel som block lytisk replikering. 3) På dagen 14 (DIV 14) är aciklovir bort och EGFP-expressioninte upptäcks. Kulturer kan upprätthållas stabilt på detta sätt under 1 månad eller mer, eller ett test variabel kan läggas att utvärdera dess förmåga att framkalla reaktivering från latens. Den variabla kan vara i form av en liten molekyl kemisk inhibitor, en antikropp mot en löslig neurotrofin eller cellyteprotein eller ett lentivirus som uttrycker antingen en genspecifik shRNA eller en ektopiskt uttryckt protein. Reaktivering sedan övervakas av poäng EGFP-positiva brunnar i realtid.

Figur 2
Figur 2. TSA reaktiverar HSV-1 i SCG-kulturer. SCG kulturer latent infekterades såsom beskrivs i figur 1. Vid DIV 14, var ACV avlägsnades och ersattes med media innehållande 1 | iM trichostatin A (TSA). (A) Kulturerna visualiserades och poängsattes med användning av fluorescensmikroskopi varje dag efter läkemedelsbehandling för en period av 5 dagar. Den procentuella andelen brunnar som genomgår reactivatjon under loppet av försöket visas jämfört med DMSO-kontroll-behandlade kulturer. Procentandel av reaktivering beräknades genom att antalet EGFP-positiva brunnar av 20 brunnar på en odlingsplatta med 96 brunnar. Felstaplarna indikerar standardfel av medelvärdet. (B) latent infekterade kulturer behandlades med TSA och en inhibitor av viralt DNA inkapsidering, WAY-150.138 (20 pg / ml). Antalet EGFP +-neuroner jämfördes 48 timmar efter behandling med läkemedel till kontrollgruppen behandlades med DMSO och WAY-150.138. Varje datapunkt representerar förhållandet mellan EGFP +-neuroner av 1000 nervceller i en odlingsbrunn. Stapeln visar den genomsnittliga andelen av EGFP + nervceller i en brunn.

Figur 3
Figur 3. EGFP detecion är beroende av viral DNA-replikation. SCG Kulturerna latent infekterade behandlades sedan med 10 pM av LY29004, en känd inducerare av reaktivering 1. Reaktivering inducerad av LY (blå) was jämfört med de som behandlats med viral DNA-syntes-hämmare, phophonoacetic syra, PAA (300μg/ml, röd) och de båda föreningarna tillsammans (grönt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna primära neuron kultur och infektion system ger en enkel och effektiv metod för att utforska de molekylära mekanismerna bakom HSV-1 latens och reaktivering. Systemet sammanfattas troget de accepterade kännetecken latens som anges i både mänskliga infektioner och i live-djurmodeller. När viruset latent i SCG kulturer, kan smittsamma partiklar och virala lytiska genprodukter inte detekteras. Den enda virala genprodukten detekteras i latent infekterade neuroner är den icke-kodande LAT-transkript, som ackumuleras inom kärnor. Reaktivering sammanfaller med uttryck av virala gener lytiska och kulminerar i produktionen av infektiösa partiklar. Vidare är denna primära neuron cellkulturmodell reagerar för återaktivering accepterade inducerare såsom TSA, som effektivt inducerar lytisk viral replikation.

Olika kemiska inducerare stimulerar reaktivering i varierande grad och med karaktäristiska kinetik. Exempelvis inducerar TSA reproducerbart reaktivering i 60-70% av kulturerna över en 5 d observationsperiod. Liknande nivåer av TSA-inducerad reaktivering har rapporterats med latent infekterade, differentierad råttfeokromocytom PC12 17 eller mus trigeminala kulturer neuron 18. Kinetiken för reaktivering vi ser och oförmåga TSA att reaktivera 100% av de kulturer kan återspegla heterogenitet i egenskap av de latenta genomen att avhämmas. I överensstämmelse med detta förslag minskar effekten av TSA-inducerad reaktivering uppgift som en funktion av tiden i kultur 18. I motsats till TSA framkallar LY29004 reaktivering i 80-90% av kulturerna inom 2-3 d. Skillnader i upprättande av latens eller MOI sannolikt inte kommer att redovisa för skillnader i inducerbar reaktivering mellan TSA och LY29004, som våra förutsättningar för att etablera latens reproducerbart resultera i ungefär 20% av nervceller som uttrycker virus kodade latens associated transkript LAT 1. Vi har emellertid ännu inte mätte fraktionen av virala genomet-positiva celler, vilket ökar möjligheten att LY29004 inducerar reaktivering i ett större antal neuroner än TSA. Även om skälen bakom den differentiella kapacitet TSA och LY20004 att förmå reaktivering återstår att fastställa, är det tydligt olika inducerande medel kan främja reaktivering med karaktäristiska effektivitet och kinetik.

En kraftfull aspekt av systemet är förmågan att använda vildtypsvirus eller reporter-stammar som uppträder som inte kan urskiljas från ett virus av vildtyp. Till skillnad från tidigare cellodlingssystem att studera HSV-1 latens, som förlitat sig på muterade HSV-varianter som inte kunde replikera produktivt 16,18,19, över 20, innehåller vårt modellsystem en EGFP-reporter stam som inte går att skilja från vildtyp virus i termer av lytisk replikationseffektivitet i odlade celler 11. Användning av en EGFP reporter motIRU möjliggör en känslig och enkel visuell bedömning av latens och reaktivering. I motsats till andra reportrar såsom β-galaktosidas, vilket kräver fixering och lys av celler för analys, tillåter EGFP forskaren att övervaka viral tillstånd under hela loppet av ett experiment, vilket ger en enkel, i realtid bedömning av spontana och inducerade reaktivering. Andra metoder, såsom kvantitativ PCR, kan också användas för att titta på virala genexpressionsmönster som föregår EGFP-uttryck, eftersom EGFP uttrycks som ett "sant-sen"-genen, eller för virusstammar som saknar en reportergen. Alternativt kan andra reporter virus där EGFP är smält till omedelbara tidiga (IE) eller tidiga (E) gener utvecklas. En fördel med att använda den "sanna-sen" EGFP-rapportör beskrivits är att EGFP-expression är stringent beroende viral DNA-syntes, vilket indikerar att viruset livscykel har fortskridit in i den slutliga genexpression fasen associerad med lytisk tillväxt. Indeed, "sann-sen" EGFP uttryck för kan upptäckas med visuell inspektion korrelerar väl med infektiöst virus produktion en biologisk indikator som produktiv reaktivering har inträffat. Det återstår dock att se om varje neuron som börjar reaktivering, mätt som produktionscykeln (lytisk) genuttryck, kan utvecklas genom hela lytiska program för att producera smittsamt virus. Kanske virus har stora möjligheter att avbryta lytiska programmet och återupprätta latens. Således kan reporter virus som uttrycker EGFP smält till IE eller proteiner E resultera i mindre tillförlitliga reaktivering avläsning. Ur detta perspektiv, att jämföra effektiviteten hos reaktivering mäts med hjälp av EGFP-reportrar som uttrycks från IE, E eller sena promotorer, eller ens en kombinerad reporter med olika fluorescerande reporter proteiner smälta till en genprodukt från varje kinetiska klass (IE vs E vs sen) skulle vara bra. Dessutom kan vår neuronala cellodlingar systemet också användas med olika HSV-1 mregnar, oavsett neuroinvasive potential eller förmågan att reglera värdens immunsvar 21-24. Slutligen kan in vitro-odling som beskrivits här kan tillämpas på andra neuronala celltyper och ex vivo perifera ganglier kulturer erhållna från högre ordningens arter, inklusive människor 25-27.

Genom att använda en ren population av nervceller, detaljerade studier av samspelet mellan hsv1 och neuronal värd på molekylär nivå är nu möjligt. Betecknande undviker detta modellsystem de många komplexa frågor som hänger samman med att studera latens och reaktivering hos immunkompetenta djur, där ytterligare nivåer kontrollmaterial är skiktade ovanpå grundläggande virus-neuron interaktioner. Dessutom visar arbete i detta system tydligt att det faktiskt finns ett stabilt samband mellan virus och värd neuron som kan etableras och upprätthållas utan hjälp av en förvärvad immunsvar. Medan medfödd och ADAPTIVe immunitet tydligt spelar viktiga roller i biologi latenta HSV-infektioner har viruset inneboende kapaciteten i) Upprätta en icke-produktiv infektion som liknar latens i nervceller, och ii) att byta till en lytisk, produktiv replikering program svar på miljö och neuronala signaler appliceras på neuroner enbart. Viktigt kan den molekylära grunden för detta unika förhållande mellan HSV och neuron nu dissekeras med cellbiologiska, farmakologiska, geners uttryck och gen verktyg leverans 1. Studier av detta slag som är inriktade på neuron och virus isolerat är inte möjliga i djurmodeller där flera celltyper bor i ganglial facket. Vi hoppas att genom att använda denna modell system, en omfattande förståelse av den intrikata molekylära kretsen reglera HSV-1 latens i nervceller kan äntligen uppnås. När det är möjligt, kan principer erfarenheter som samlats från detta odlade neuron systemet sedan testas in vivo med en etablerad djur models, som illustrerar den kompletterande karaktären hos dessa två förhållningssätt till övergripande undersökning av HSV-1 latens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar granskarna för deras genomtänkta förslag som bidragit till att förbättra detta manuskript. Detta arbete har finansierats med bidrag till MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) och IM (AI073898, GM056927) från NIH. MK stöddes delvis av en NIH utbildningsstipendium (5T32 AI007180).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

Tags

Immunologi 62 numret neuron cellodling Herpes Simplex-virus (HSV) molekylär biologi virologi
En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, … More

Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter